[发明专利]用于靶向抑制HIV-1前病毒表达的表达载体及其制备方法和应用

说明书

本发明属于基因治疗领域，涉及嵌合锌指结构的DNA甲基转移酶靶向抑制HIV‑1前病毒表达的表达载体的制备及应用；本发明的携带嵌合锌指结构的DNA甲基转移酶的表达载体经在HIV‑1感染及潜伏感染细胞模型中证实可抑制HIV‑1前病毒表达的沉默，该种载体在病毒感染细胞和潜伏感染细胞中能有效的抑制病毒复制,且可持续15天和40天以上。此外，嵌合锌指结构的DNA甲基转移酶表达载体造成的前病毒表达沉默能够在细胞代际之间遗传且在细胞中具有一定的安全性。本发明为治愈艾滋病提供了新的思路。

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及用于靶向抑制HIV-1前病毒表达的表达载体及其制备方法和应用，尤其涉及用于靶向抑制HIV-1前病毒表达的嵌合锌指结构的DNA甲基转移酶的表达载体的制备及应用。

背景技术

研究显示，艾滋病(Acquired immunodeficiency virus，AIDS)不能被完全治愈的主要原因是由于HIV-1藏匿于其感染的免疫细胞，可通过表观遗传等机制发生基因沉默(gene silencing)，从而逃避免疫系统和抗逆转录病毒药物的攻击。然而，研究还显示，这些潜伏感染细胞中的HIV-1前病毒的基因沉默具有可逆性，一旦遇到适当的条件，病毒又能迅速恢复其复制和转录能力，进而引发病毒的再次感染。有研究人员认为，倘如将潜伏感染细胞中的HIV-1前病毒永久沉默，则有可能实现宿主和HIV-1病毒“和平共处”的状态，从而实现功能性治愈。

有报道，与HIV-1病毒极为相似的人类内源性逆转录病毒(human endogenousretroviruses,HERV)被认为是整合到人类基因组中的古老逆转录病毒，它们可对人体产生破坏，但因强大的人类基因组最终将其同化，使其成为基因组的一部分，与人类宿主“和平共处”，甚至帮助宿主调控基因转录或抵抗新的逆转录病毒感染。有研究人员认为，倘如能严格调控HIV-1潜伏感染细胞中的前病毒，使其病毒的转录受到稳定的抑制，阻止病毒载量的反弹，或许能够使得HIV-1像HERV一样，实现宿主和HIV-1病毒“和平共处”的状态，达到功能性治愈。

现有技术公开了DNA甲基化是哺乳动物中常见的表观遗传标志，是基因组印记、转座子沉默和差异化基因表达的表观遗传学机制。DNA甲基化发生在CpG二核苷酸的胞嘧啶残基上，常见于CpG岛(CpG islands,CGIs)样的CpG富集区域。传统的甲基化建立-维持模型将DNA甲基转移酶分为从头甲基转移酶(de novo DNMT)和维持甲基转移酶(MaintenanceDNMT)两大类；前者主要是Dnmt3a和Dnmt3b，它们负责甲基化的建立，在胚胎发育过程中起重要作用；后者主要是Dnmt1，它对半甲基化的DNA序列具有很高的亲和性，负责在DNA复制过程中将甲基化标记传递给子代。此外，DNA甲基化模式还能在细胞代际之间遗传，对甲基化的基因保持长期稳定的抑制。2013年，Martinez-Colom A等构建了含有可靶向HIV-1调控区LTR(Long terminal repeat)的HIV-1整合酶结构域和DNA甲基化转移酶Dnmt3b的催化域的嵌合蛋白表达载体，发现该嵌合蛋白可以引起HIV-1调控区甲基化并导致HIV-1表达抑制，但是，HIV-1整合酶存在着“脱靶”的安全性隐患。最近，基于ZFN(Zinc fingernuclease)、TALEN(Transcription activator-like effector nuclease)和CRISPR系统(Clusteredregularly interspaced short palindromic repeat)的基因编辑技术的问世为该问题的解决开辟了新的途径。Li等利用嵌合DNA甲基转移酶的ZFP重组蛋白靶向HSV基因启动子区域，实现了因靶基因甲基化致使基因沉默的目的；Blancafort等将六锌指结构与Dnmt3a结合，成功诱导了Maspin和SOX2基因启动子位点的DNA甲基化，使得基因表达下调；同时，该研究表明这种沉默作用能够在体内持续存在。最近，Aleksandar等将内切酶失活的Cas9核酸酶(dCas9)与Dnmt3a的催化结构域融合并成功靶向了IL6ST和BACH2基因，使得基因表达下调。