[发明专利]一种脱细胞角膜缘保护液及脱细胞角膜缘的制备方法

说明书

本发明涉及生物工程医疗材料领域，公开了一种脱细胞角膜缘保护液及脱细胞角膜缘的制备方法。本发明的脱细胞角膜缘保护液的成分为含有5～12g/L透明质酸、5～20g/L硫酸软骨素、3～10g/L低分子右旋糖酐和2.5～5mg/L妥布霉素的PBS缓冲液。将含前弹力层的新鲜猪角巩膜缘基质密封于所述脱细胞角膜缘保护液中，采用高静压处理破碎细胞；将细胞破碎后的角膜缘置于添加了去垢剂和核酸酶的所述脱细胞角膜缘保护液中进行震荡脱细胞处理；将脱细胞后的角膜缘置于所述脱细胞角膜缘保护液中漂洗完成制备。采用本发明的方法所获取的脱细胞角膜缘，脱细胞彻底，最小的减少了对角膜缘结构的破坏，生物相容性好，有利于自体细胞增殖爬行。

技术领域

本发明涉及生物工程医疗材料领域，尤其涉及一种脱细胞角膜缘基质。

背景技术

角膜缘是角膜和巩膜的移行区，是角膜缘干细胞(1imbal stem cells，LSCs)的所在之处，对角膜透明性的维持和正常生理功能的发挥具有重要的作用。严重的眼表疾病可损伤角膜缘区，导致LSCc的缺失及屏障结构的破坏，从而引起一系列的眼表反应，甚至导致失明。例如当眼部遭受严重化学伤、热烧伤等损伤后，角膜缘被广泛破坏，部分或全部角膜缘干细胞缺乏，导致角膜上皮修复困难，结膜上皮向角膜生长，新生血管长入、角膜结膜化和基质瘢痕化，最终导致失明。

目前，同体和同种异体LSCs移植受限于匮乏的供体来源无法满足临床治疗的需要，所以胚胎干细胞联合组织工程负载材料制备植片进行移植是目前治疗角膜缘干细胞缺乏的重要方法。角膜缘区独特的三维组织结构及基底膜成分是LSCs赖以生存及干细胞特性维持的重要基础之一。人类角膜缘基质是构建组织工程LSCs植片的最佳支架材料，但同样受到供体来源匮乏的限制。目前，猪的多种脱细胞组织材料已成功应用于组织工程器官再造领域的研究。随着生物组织工程学的广泛和深入研究，脱细胞处理和病毒灭活等工艺制备的异种角膜基质材料在动物水平和临床应用中取得了初步的治疗效果，但鲜有脱细胞角膜缘基质的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种脱细胞角膜缘保护液，能够避免物理、化学和生物学等处理对角膜缘三维组织结构及基底膜的破坏。

本发明的另外一个目的是提供一种脱细胞角膜缘的制备方法，该方法能保持角膜缘纤维层结构的完整，使脱细胞后的角膜缘保持其特有的纤维结构排列和生物特性，能够作为一种应用前景很好的生物工程材料。

具体的技术方案如下：

一种脱细胞角膜缘保护液，其成分为含有5～12g/L透明质酸、5～20g/L硫酸软骨素、3～10g/L低分子右旋糖酐和2.5～5mg/L妥布霉素的PBS缓冲液。

优选的，所述脱细胞角膜缘保护液的成分为含有7～10g/L透明质酸、10～15g/L硫酸软骨素、5～8g/L低分子右旋糖酐和3～4mg/L妥布霉素的PBS缓冲液。

优选的，所述脱细胞角膜缘保护液的pH值为7.2～7.4。

优选的，所述脱细胞角膜缘保护液的渗透压为300～400mOsm。

本发明还包括采用上述脱细胞角膜缘保护液制备脱细胞角膜缘的方法，包括以下步骤：

(1)将含前弹力层的新鲜猪角巩膜缘基质密封于所述脱细胞角膜缘保护液中，采用高静压处理破碎细胞；

(2)将细胞破碎后的角膜缘置于添加了去垢剂和核酸酶的所述脱细胞角膜缘保护液中进行震荡脱细胞处理；

(3)将所述脱细胞后的角膜缘置于所述脱细胞角膜缘保护液中漂洗。

其中，所述高静压处理破碎细胞的条件为：压力为100～600MPa，高静压频率为2～5次，每次为1～2分钟，总时间不超过10分钟。