[发明专利]一种用于马铃薯茎段体胚高效再生及遗传转化的培养基及方法

权利要求书

1.一种用于马铃薯茎段体胚高效再生及遗传转化的方法，其特征在于，运用马铃薯茎段体胚高效再生及遗传转化的培养基，所述培养基包括1.0 mg/L的6-BA、0.2 mg/L的TDZ、0.05 mg/L的2,4-D，以及0.1 mg/L的GA₃，所述培养基包括预/共培养基、固体筛选培养基及液体筛选培养基，所述方法包括：

（1）预培养，剪取马铃薯试管苗茎段，去除腋芽并剪成0.5~1cm作为外植体接种在预/共培养基中预培养2~4d；

（2）农杆菌侵染和共培养，将所述茎段于一农杆菌菌液中侵染3~5min，用无菌水清洗后移至无菌滤纸上去掉多余水分，再接入垫有2~3层无菌滤纸的预/共培养基中，24℃黑暗共培养36h；

（3）筛选培养，共培养后将所述茎段放入含100 mg/L Cef的无菌水中清洗3~4遍，吸掉多余水分后转入一固体筛选培养基中培养7d~14d，去除因农杆菌而过度生长的致死、污染和完全白化外植体，然后换入液体筛选培养基中继续培养，培养20d~40d后可分化出大量芽；

（4）生根培养，剪下分化出的芽接入一生根筛选培养基中培养10d。

2.如权利要求1所述的用于马铃薯茎段体胚高效再生及遗传转化的方法，其特征在于，

所述预/共培养基的组成为：MS+1.0 mg/L6-BA+0.2 mg/LTDZ+0.05 mg/L2,4-D+0.1mg/LGA₃+3%蔗糖+0.6%琼脂；

所述固体筛选培养基的组成为：MS+1.0 mg/L6-BA+0.2 mg/LTDZ+0.05 mg/L2,4-D+0.1mg/LGA₃+3%蔗糖+0.6%琼脂+50 mg/L Kan+ 100 mg/L Cef+250 mg/L Car；

所述液体筛选培养基的组成为：MS+1.0 mg/L6-BA+0.2 mg/LTDZ+0.05 mg/L2,4-D+0.1mg/LGA₃+3%蔗糖+50 mg/L Kan+200 mg/L Cef+500 mg/L Car。

3.如权利要求1所述的用于马铃薯茎段体胚高效再生及遗传转化的方法，其特征在于，所述步骤（1）前还包括马铃薯试管苗扩繁的步骤：

剪取带1~2个腋芽的马铃薯试管苗茎段接入含MS+3%蔗糖+0.6%琼脂的培养基中，调节pH为5.9~6.0，16h光/8h暗，光强为60 µmol m^-2s^-1，温度为22±1℃，繁殖系数为3~4倍，每隔10d~14d剪接扩繁1次。

4.如权利要求1所述的用于马铃薯茎段体胚高效再生及遗传转化的方法，其特征在于，所述步骤（2）前还包括制备农杆菌菌液的步骤：

挑取含目的基因AtGAPC2的农杆菌GV3101单菌落，接种至液体YEB中过夜培养，然后按1：200的比例稀释菌液于液体YEB中，培养至OD₆₀₀=0.3~0.4，取菌液于4000rpm下离心5min然后去上清，再加入等量的液体MS重悬菌体备用。

5.如权利要求4所述的用于马铃薯茎段体胚高效再生及遗传转化的方法，其特征在于，所述YEB含50 mg/L Kan、100 mg/L Rif及25 mg/L Gen。

6.如权利要求1所述的用于马铃薯茎段体胚高效再生及遗传转化的方法，其特征在于，所述生根筛选培养基含MS、3%蔗糖、0.6%琼脂、50 mg/L Kan、100 mg/L Cef及250 mg/LCar。

7.如权利要求1所述的用于马铃薯茎段体胚高效再生及遗传转化的方法，其特征在于，所述步骤（4）之后还包括PCR检测阳性率的步骤：

采用CTAB法提取生根筛选培养基培养后能正常长根的株系的叶片基因组DNA，PCR扩增反应后采用琼脂糖凝胶电泳法检测目的条带，确性阳性株系。