[发明专利]一株利用木糖高效发酵乙醇的转基因工程酿酒酵母SF4

说明书

本发明公开了一株利用木糖高效发酵乙醇的转基因工程酿酒酵母SF4，涉及酿酒酵母技术领域。酿酒酵母SF4是通过寡肽链[‑(G4S1)3‑]链接的2个木糖利用酶即木糖还原酶XYL1和木糖醇氧化酶XYL2构成的融合蛋白基因；XYL1的基因序列如SEQ ID NO：1，XYL2的基因序列如SEQ ID NO：2，融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：3。将转基因工程酿酒酵母SF4应用于秸秆水解产物的乙醇发酵中。本发明的SF4菌株生长量比对照提高1.5倍；葡萄糖和木糖共发酵的发酵时，SF4菌株木糖利用率达到53.8%；芒草材料水解液的乙醇发酵中，乙醇产量菌株SF4提高4.5倍左右。

技术领域

本发明涉及酿酒酵母技术领域，尤其涉及一株利用木糖高效发酵乙醇的转基因工程酿酒酵母SF4。

背景技术

木糖是秸秆水解产物中含量最丰富的一种五碳糖，但是却不能被传统的酿酒酵母所利用。充分将木糖转化成乙醇是秸秆资源合理有效利用的关键性环节。应用基因工程构建重组酵母菌株，提高其木糖发酵能力在理论上完全可行，故近三十年来，国内外已有大量的转基因工程技术手段应用于改良酿酒酵母的报道，旨在获得和提高酿酒酵母发酵木糖的能力。虽已取得一定的进展，但相关转基因酵母仍然存在以下问题：1、乙醇产率较低；2、乙醇及发酵抑制物的耐受性不高；3、重组菌株稳定性不好；4、高浓度糖的耐受性不高。

发明内容

本发明的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供一株利用木糖高效发酵乙醇的转基因工程酿酒酵母SF4。

本发明的目的是这样实现的：

一、转基因工程酿酒酵母SF4（简称酿酒酵母SF4）

酿酒酵母SF4是通过寡肽链[-(G4S1)3-]链接的2个木糖利用酶即木糖还原酶XYL1和木糖醇氧化酶XYL2构成的融合蛋白基因；

XYL1的基因序列如SEQ ID NO：1，XYL2的基因序列如SEQ ID NO：2，融合蛋白的基因序列如SEQ ID NO：3；

酿酒酵母SF4于2016年10月17日保藏在中国典型培养物保藏中心（地址：中国 武汉 武汉大学 邮编：430072），保藏编号为CCTCC NO：M 2016563。

该融合蛋白基因被证实不仅能够使天然不能利用木糖的酿酒酵母获得利用木糖的能力，能以木糖作为唯一碳源转化成为乙醇，还能够在以单一木糖、木糖+葡萄糖或稻草等秸秆水解液的发酵中，进行高效乙醇发酵。

二、酿酒酵母SF4的获得方法

将木糖代谢途径中关键酶基因木糖还原酶基因xyl1和木糖醇氧化酶基因xyl2通过寡肽-（G₄S₁）₃-DNA序列连接，然后与木酮糖激酶基因 xks1一道构建到整合型表达载体pAUR101上，并转化到高温酿酒酵母SF7中。

对得到的酿酒酵母转化子进行生长曲线测定，转录水平测定，蛋白表达含量测定，酶活测定，木糖唯一碳源发酵产物含量测定，木糖葡萄糖共发酵产物含量测定，芒草秸秆材料稀硫酸预处理酶解后发酵产物含量测定实验。

三、转基因工程酿酒酵母SF4的应用

秸秆是最丰富的资源之一，我国每年未被利用的农作物秸秆资源达5亿吨之多；农作物秸秆的基本成分是半纤维素、纤维素和木质素，这三者大约各占30%的比例；传统的酿酒酵母只能利用其中的纤维素分解产物，这是以秸秆酿造乙醇未能产业化的重要瓶颈之一。

将转基因工程酿酒酵母SF4应用于秸秆水解产物的乙醇发酵中；

除了具备传统的酿酒酵母生产菌株对该产物中纤维素分解后的6碳糖高效利用以外，还能够高效发酵利用该产物中半纤维素分解后的5碳糖，大大提高对原料资源的利用率。

本发明具有下列优点和积极效果：