[发明专利]一种热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体及其构建方法

说明书

本发明提供了一种热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体及其构建方法，其中脂肪氧合酶突变体具有如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6中任一种所示的氨基酸序列；构建方法为首先确定鱼腥藻脂肪氧合酶突变位点，然后以重组质粒为模板，在突变位点处利用NNK代替原有密码子设计简并引物，进行全质粒PCR反应，构建3个定点饱和突变库，然后通过转化大肠杆菌和抗性筛选得到3个饱和突变库；最后对3个饱和突变库进行抗性筛选和诱导突变，通过进一步纯化得到纯的脂肪氧合酶突变体。本发明的脂肪氧合酶突变体的热稳定性获得了提高，具有较高的实际应用价值和广阔的市场前景。

技术领域

本发明涉及生物技术，具体涉及一种热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体及其构建方法。

背景技术

LOX（Lipoxygenase，LOX）是非血红素、非硫铁过氧化酶，它能催化具有顺,顺-1,4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸及其酯类发生空间及位置特异性的双加氧反应，生成相应的氢过氧化物。在植物中其天然底物主要是亚油酸和亚麻酸，在动物体内其天然底物主要是花生四烯酸。LOX作为无毒、无害、天然的添加剂在食品、医药、化工等领域有着重要的应用价值。在面粉的加工过程中它能够将面粉中的多不饱和脂肪酸催化氧化成氢过氧化物，这些氢过氧化物能够起到提高面粉白度，增强面筋蛋白强度的作用。另外，在污水处理与环境保护方面，可以用于染料的降解。然而脂肪氧合酶热稳定性差的缺陷限制了其在工业上的应用。因此，通过分子改造来提高脂肪氧合酶热稳定性以期获得酶学性质更适用工业应用的突变酶是目前的研究热点。

发明内容

本发明目的是为了提供一种酶活与热稳定性同时提高的脂肪氧合酶突变体及其构建方法，提高了脂肪氧合酶突变体的热稳定性，扩展了应用范围。

本发明的技术方案如下：

一种热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体，该脂肪氧合酶突变体具有如SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6中任一种所示的氨基酸序列。

一种以上所述的热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体中PCR反应的简并引物，其特征在于，该简并引物具体如下：

N130-f：TTACTCACNNKCTGGCAAAATATGACATCAAG；

N130-r：TTTGCCAGMNNGTGAGTAAGCTCATGTG；

S437-f：GGAAAAATCANNKATATTGGAACCAGGACTTC；

S437-r：TCCAATATMNNTGATTTTTCCCGAATGAGCG；

G260-f：GCTAACGCAGNNKTCTATTGTTGATGTAA；

G260-r：AACAATAGAMNNCTGCGTTAGCATG。

一种以上所述的热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体的构建方法，包括以下步骤：

（1）鱼腥藻脂肪氧合酶突变位点确定：将鱼腥藻脂肪氧合酶自N端起第130位天冬酰胺、260位甘氨酸和437位丝氨酸作为饱和突变位点；

（2）鱼腥藻脂肪氧合酶突变体库的建立及突变体筛选：以重组质粒为模板，在第130位天冬酰胺、260位甘氨酸和437位丝氨酸相对应的核苷酸处利用NNK代替原有密码子设计简并引物，该简并引物如以上所述，进行全质粒PCR反应，构建3个定点饱和突变库，DpnI消化模板，纯化后产物直接转化大肠杆菌，将转化后的大肠杆菌涂布于含有100 μg/ml氨苄抗性LB平板上，37℃下培养16-24小时，得到3个饱和突变库；