[发明专利]一种热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体及其构建方法

权利要求书

1.一种热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体，其特征在于，脂肪氧合酶突变体具有如SEQID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6中任一种所示的氨基酸序列。

2.一种构建权利要求1所述的热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体中PCR反应的简并引物，其特征在于，该简并引物具体如下：

N130-f：TTACTCACNNKCTGGCAAAATATGACATCAAG；

N130-r：TTTGCCAGMNNGTGAGTAAGCTCATGTG；

S437-f：GGAAAAATCANNKATATTGGAACCAGGACTTC；

S437-r：TCCAATATMNNTGATTTTTCCCGAATGAGCG；

G260-f：GCTAACGCAGNNKTCTATTGTTGATGTAA；

G260-r：AACAATAGAMNNCTGCGTTAGCATG。

3.一种权利要求1所述的热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）鱼腥藻脂肪氧合酶突变位点确定：将鱼腥藻脂肪氧合酶氨基酸序列SEQ ID NO.1中自N端起第130位天冬酰胺、260位甘氨酸和437位丝氨酸作为饱和突变位点；

（2）鱼腥藻脂肪氧合酶突变体库的建立及突变体筛选：以重组质粒为模板，在鱼腥藻脂肪氧合酶氨基酸序列SEQ ID NO.1中第130位天冬酰胺、260位甘氨酸和437位丝氨酸相对应的核苷酸处利用NNK代替原有密码子设计简并引物，该简并引物如权利要求2所述，进行全质粒PCR反应，构建3个定点饱和突变库，DpnI消化模板，纯化后产物直接转化大肠杆菌，将转化后的大肠杆菌涂布于含有氨苄抗性LB平板上，37℃下培养16-24小时，得到3个饱和突变库；

（3）取3个饱和突变库的菌落接种于含有氨苄LB培养基的96孔板中，于37℃过夜培养，得到3个突变体库的母版，取母版接种于含有氨苄LB培养基的96孔板中，37℃下培养3h，再加入IPTG低温诱导16h；然后裂解菌体，得到粗酶液，将粗酶液在50℃条件下孵育5min，冷却，测定残余活力，得到阳性突变体；

（4）将步骤（3）得到的阳性突变体接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，180rpm 培养至OD600为0.6-0.8 时，加IPTG低温诱导，离心收集菌体，用磷酸盐缓冲液重悬菌体，超声波破碎菌体，将上清液过Ni-NTA亲和柱纯化，透析去除咪唑即得到纯的脂肪氧合酶突变体；纯酶液测定50℃下的半衰期，确定每个突变体库中热稳定性最高的突变体，得到三个热稳定性与酶活提高的突变体，分别为N130D，G260A和S437T；以N130D的基因作为模板，进行突变体组合：针对260位甘氨酸、437位丝氨酸位点设计饱和突变库，并进行新一轮的筛选；经过组合突变，获得了两株热稳定性与酶活力显著提高的突变株，分别为：N130D/G260Q，N130D/S437Y。

4.根据权利要求3所述的热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体的构建方法，其特征在于，步骤（2）中大肠杆菌为大肠杆菌E. coli BL21(DE3)。

5.根据权利要求3所述的热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体的构建方法，其特征在于，步骤（2）中重组质粒为重组质粒pET32a-Ana-LOX。

6.根据权利要求3所述的热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体的构建方法，其特征在于，步骤（2）中全质粒PCR反应的反应条件为：96℃ 5 min；然后98℃ 10s，55℃ 5s，72℃ 90s，共25个循环；最后72℃ 5 min。

7.根据权利要求3所述的热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体的构建方法，其特征在于，步骤（3）中裂解菌体采用冻融破碎的方法进行，具体为-70℃冷冻2小时，室温融化1小时，反复冻融。

8.权利要求1所述的热稳定性提高的脂肪氧合酶突变体在食品、制药、造纸或污水处理中的应用。