[发明专利]一种高同型半胱氨酸血症诱导肝脏纤维化模型的建立方法

说明书

本发明公开了一种小鼠肝脏纤维化模型的建立方法，属于医学肝脏疾病研究领域。本发明利用目前蛋氨酸口服给药建立高同型半胱氨酸血症来诱导建立小鼠肝脏纤维化模型，然后通过血中同型半胱氨酸测定，蛋白印记法测定和组织马松染色和免疫组化方法鉴定。本发明建立的小鼠肝脏纤维化模型操作简单，周期短，成功率高。该纤维化模型的建立为深入研究纤维化的发病机制，各种治疗药物的初步筛选等提供了一个可靠的动物模型。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种高同型半胱氨酸血症诱导肝脏纤维化模型的建立方法。

背景技术

Hcy是一种含硫氨基酸，是蛋氨酸代谢的中间产物，参与了蛋氨酸循环的关键环节。血液中的HCY升高到一定程度(通常16uM)即形成高同型半胱氨酸血症。高同型半胱氨酸血症的临床表现是多种多样的，包括脂肪肝、肝纤维化。

肝纤维化是一个世界范围内的严重的疾病。它是由肝内结缔组织异常增生导致肝细胞损伤引起的。病理因素包括病毒性肝炎、酒精中毒、免疫性损伤，细胞外基质等。在肝硬化阶段，大量的细胞外基质(ECM)沉积引起的肝功能损害是不可逆的。肝纤维化的病理过程可以停止甚至可以部分逆转。

泛素水解酶22(USP22)是新发现的泛素水解酶家族成员，是一种组蛋白去泛素化酶，在核受体介导的基因转录调控中起增强转录活性的作用。目前报道的泛素水解酶22多与肿瘤的恶性程度、增殖、转移及预后等相关，但在肝纤维化中的表达情况尚不清楚。

发明内容

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种高同型半胱氨酸血症诱导肝脏纤维化模型的建立方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种高同型半胱氨酸血症诱导肝脏纤维化模型的建立方法，包括以下步骤：

步骤1、制备体内高蛋氨酸饮食诱导高同型半胱氨酸血症模型：

步骤2、高同型半胱氨酸血症通过USP22诱导肝脏纤维化，建立高同型半胱氨酸血症诱导肝脏纤维化模型。

进一步地，步骤1中的制备体内高蛋氨酸饮食诱导高同型半胱氨酸血症模型具体为：

步骤1.1、选择20只6-8周龄的C57BL/6小鼠，随机分成2组，每组10只，一组为正常组，喂养正常的饲料，一组为造模组，喂养含质量百分含量为2％的高蛋氨酸饲料，2周后，处死小鼠，下腔静脉采血，收集小鼠的血液检测同型半胱氨酸的水平，收集小鼠肝脏组织进行马松染色评估肝脏纤维化的情况，蛋白印记法，免疫组化法检测胶原蛋白I的表达情况，如果马松染色结果看到造模组明显纤维化，免疫组化看到造模组中细胞胞外，胞质中胶原蛋白I表达明显，具有明显的统计学意义，则造模成功；

步骤1.2、确定体内HCY诱导肝星状细胞纤维化的最佳处理时间：正常培养的肝星状细胞，采用初定浓度为24μM同型半胱氨酸预处理，分别12h，24h，48h，72h后收集细胞，采用蛋白印记法，免疫荧光法检测胶原蛋白I的表达情况；

步骤1.3、确定处理浓度：正常培养的肝星状细胞，采用浓度为6-48μM同型半胱氨酸预处理，48小时后收集细胞，采用蛋白印记法，免疫荧光法检测胶原蛋白I的表达情况。

进一步地，步骤2中的高同型半胱氨酸血症通过USP22诱导肝脏纤维化，建立高同型半胱氨酸血症诱导肝脏纤维化模型具体为：

步骤2.1、体内：采用蛋白印记法，免疫组化法检测泛素水解酶22在正常小鼠和肝脏纤维化小鼠肝脏组织中的表达情况，模型组中尾静脉注射siRNA USP22预处理，下调泛素水解酶22在纤维化小鼠肝脏中的表达，收集肝脏组织进行HE，马松染色评估肝脏纤维化的情况，蛋白印迹，免疫组化检测泛素水解酶22、胶原蛋白I的表达情况；