[发明专利]新型蛇足石杉来源的赖氨酸脱羧酶及其编码基因和应用

说明书

本发明涉及新型蛇足石杉来源的赖氨酸脱羧酶及其编码基因和应用。具体而言，本发明提供一种多肽，选自：(1)SEQ ID NO:4、6、8、10、12和14所示的多肽序列；和(2)在(1)所述的多肽序列中经过插入、缺失或突变一个或几个氨基酸且具有赖氨酸脱羧酶活性的由(1)衍生的多肽；和(3)由SEQ ID NO:4、6、8、10、12或14所示多肽序列与促进SEQ ID NO:4、6、8、10、12或14所示多肽序列表达、分泌到胞外或纯化的多肽序列组成的多肽。本发明首次从蛇足石杉中鉴定到赖氨酸脱羧酶，并验证体外和体内活性。利用该赖氨酸脱羧酶应可提高石松类生物碱尤其石杉碱甲的产量，因此具有较好的应用前景。

技术领域

本发明涉及新型蛇足石杉来源的赖氨酸脱羧酶及其编码基因和应用。

背景技术

石杉碱甲是从中国传统草药千层塔(石松类石松属植物种蛇足石杉)提取出来的石松类生物碱，其是乙酰胆碱酯酶的有效抑制剂，具有治疗老年痴呆症巨大应用前景。石杉碱甲的生物合成途径的研究一直是困扰众多国内外研究者的难题，之前放射性同位素喂养的实验预测出了其分子结构水平的合成途径，此途径指出赖氨酸脱羧酶(LDC)以及铜胺氧化酶(CAO)是两个石松类生物碱合成的起始步骤。CAO已经被其他研究人员鉴定，但本领域尚未鉴定到富产石杉碱甲的蛇足石杉来源的LDC。

发明内容

本发明利用兼并引物以及快速扩张cDNA末端的方法获得6个全新的来源于蛇足石杉的编码LDC的序列。此外，本发明在体外以及体内进行了偶联反应，建立了定量检测反应中间体的方法。

本发明第一方面提供一种多肽，选自：

(1)SEQ ID NO:4、6、8、10、12和14所示的多肽序列；

(2)在(1)所述的多肽序列中经过插入、缺失或突变一个或几个氨基酸且具有赖氨酸脱羧酶活性的由(1)衍生的多肽；和

(3)由SEQ ID NO:4、6、8、10、12或14所示多肽序列与促进SEQ ID NO:4、6、8、10、12或14所示多肽序列表达、分泌到胞外或纯化的多肽序列组成的多肽。

本发明第二方面提供一种多核苷酸序列，选自：

(1)编码本发明第一方面所述多肽的多核苷酸序列；和

(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。

在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸序列选自SEQ ID NO:3、5、7、9、11和13所示的核苷酸序列。

本发明第三方面提供一种核酸构建物，其含有本发明第二方面所述的多核苷酸序列。

在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是表达载体。

本发明第四方面提供一种宿主细胞，其含有本发明的核酸构建物，如表达载体。

本发明第五方面提供本发明多肽、多核苷酸序列、表达载体在制备石松类生物碱尤其是石杉碱甲中的应用。

本发明第六方面提供一种检测LDC的酶催化产物的方法，所述方法包括使用3,5-二硝基苯甲酰氯来检测待检测的反应体系中的尸胺的步骤。

本发明第七方面提供一种检测CAO的酶催化产物的方法，所述方法包括使用3,5-二硝基苯甲酰氯来检测待检测的反应体系中的5-氨基戊醛的步骤。

本发明第八方面提供一种检测LDC和CAO的酶催化产物的方法，所述方法包括使用3,5-二硝基苯甲酰氯来检测待检测的反应体系中的尸胺和5-氨基戊醛的步骤。

在第六方面的一个或多个实施方案中，所述方法包括向待检测的反应体系中加入3,5-二硝基苯甲酰氯，使其充分反应后检测下式所示的衍生物A的存在和/或含量：