[发明专利]一种基于Fe3O4纳米探针的EGFR免疫组化检测试剂盒及其使用方法

说明书

本发明公开了一种基于Fe3O4纳米探针的EGFR免疫组化检测试剂盒及其使用方法。所述试剂盒包括：柠檬酸修复粉剂；内源性过氧化物酶阻断剂；非特异性结合位点阻断剂；DAB浓缩液；DAB显色底物；DAB稀释液；Fe3O4纳米探针；TBS粉剂；苏木素染色液。本发明给出了一种新的纳米颗粒偶联抗体的方法，巧妙地将Fe3O4纳米颗粒的高类过氧化物酶活性和EGFR单域抗体的生物特性结合起来，得到的Fe3O4纳米探针表面负载较多的EGFR单域抗体。所述Fe3O4纳米探针由表面携带金属离子的Fe3O4纳米颗粒与C端带有His‑Tags的EGFR单域抗体配位形成，具有尺寸小，稳定性好，特异性高、灵敏度高和催化活性高的优点。通过所述试剂盒可以方便快捷地检测肿瘤病理组织EGFR表达水平，从而为肿瘤治疗提供依据。

技术领域

本发明涉及一种生物纳米材料及其制备方法，尤其涉及一种检测EGFR的Fe3O4纳米探针及其试剂盒制作方法。

背景技术

免疫组织化学检测，简称免疫组化检测，是一种利用带有显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和标记物显示反应，对组织的相应抗原进行定位、定性、定量测定的生物检测技术。免疫组化是一种用于肿瘤诊断和鉴别的病理诊断方法，广泛用于临床。其应用方向包括：(1)对恶性肿瘤的诊断和鉴别；(2)对某类肿瘤进行病理分型；(3)确定转移性恶性肿瘤原发部位；(4)诊断软组织肿瘤；(5)鉴别和发现微小转移灶，为临床治疗方案的制定提供参考。免疫组化根据标记物的种类可分为免疫荧光法、免疫酶法、免疫金法和免疫荧光法等。其中免疫酶法因灵敏度高、操作简单、对设备依赖少等特点被普遍使用，具有较强的实用性，是临床使用最为广泛的免疫组化方法。在免疫酶法检测中，辣根过氧化物酶是最为常用的一种标记物。

近年来，多种无机纳米材料被提出具有类似天然酶的活性，可以作为天然酶的模拟物应用于生物催化和检测。这些纳米模拟酶具有造价低、活力稳定、易于贮存和运输等优势，然而，其催化活性与天然酶相比仍有一定差距。如何提高纳米酶的活性是纳米模拟酶领域的重要研究方向。Fe3O4纳米颗粒在模拟酶领域受到了广泛的关注，被认为是一种高性能的人工模拟酶。由于Fe3O4纳米颗粒比表面积大，表面具有大量高活性的Fe2+和Fe3+，从而可以通过Fenton反应表现出较高的类辣根过氧化物酶的活性，且其催化活性易于维持稳定，具有代替辣根过氧化物酶作为免疫组化标记物的潜力。

要实现Fe3O4纳米颗粒的标记作用，首先需要将Fe3O4纳米颗粒与抗体等生物分子进行偶联。纳米颗粒与生物分子偶联制备纳米探针一直是纳米颗粒在生物检测领域中的研究热点。偶联技术的关键在于在保持复合物的稳定性和特异性的同时获得较高的偶联效率。根据当前研究结果，纳米颗粒和生物分子偶联的方法有四类：(1)通过纳米颗粒和生物分子表面的相异电荷进行静电吸附；(2)通过纳米颗粒表面的官能团与生物分子的官能团进行化学反应；(3)将生物素与链酶亲和素分别修饰到纳米颗粒和生物分子上，再通过生物素与链酶亲和素进行特异性结合；(4)利用碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)等双功能偶联剂将纳米颗粒表面修饰的官能团与靶向分子所含的官能团进行共价偶联。第四种方法最为常用，以EDC/NHS法最为常见，它可以将纳米颗粒表面和生物分子所携带的氨基和羧基进行偶联。但是EDC/NHS法对官能团没有选择性，即抗体上的所有羧基和氨基都可以参加偶联反应。这容易造成多个纳米颗粒与同一个抗体偶联，出现交叉偶联的情况，从而对探针的稳定性产生负面影响。另外，也可能导致抗体的抗原结合片段Fab片段的官能团被占用，由于空间效应导致抗体结构发生变化从而改变其活性，影响生物分子的生物效能。因此，开发出能够解决这四类偶联方法弊端的新偶联方法，对于纳米材料在检测领域的应用尤为重要。