[发明专利]浮萍活体原生质体制备方法

说明书

本发明公开了一种浮萍活体原生质体制备方法，按照下述技术方案进行：调整Datko培养基的PH至5～6，进行高压灭菌；将浮萍培养于Datko培养基上，每周继代1～2次，得到浮萍植株；在25～28℃下将浮萍植株放入甘露醇溶液中至所述浮萍植株发生质壁分离；在酶解温度为23～27℃的条件下，用组织酶解液在黑暗条件下酶解所得的浮萍植株25～30min，每间隔10～15min吹打混匀一次，得到悬浮的浮萍活体原生质体，本发明的浮萍活体原生质体制备方法可在短时间获得浮萍活体原生质体，填补了浮萍活体原生质体制备方法的空白，具有取材少、耗时短、操作简单方便和获得的原生质体浓度高的优点。

技术领域

本发明属于植物原生质体活体制备方法技术领域，具体来说涉及一种浮萍活体原生质体制备方法。

背景技术

浮萍是单子叶水面漂浮植物，隶属于浮萍科浮萍属，广布于世界各地，其个体小，扩繁快，对环境的适应能力强，对盐碱水环境有一定的抗性。此外，浮萍淀粉含量高，在生物能源开发利用方面也具有一定的优势，是一种具有环境优势的水生植物。在国际上，浮萍对污水的净化和用于能源生产的研究得到科学家的广泛关注，但这些研究大多集中于静态的生理指标的测定，活体的研究相对较少。浮萍活体原生质体的制备，可应用于浮萍细胞融合、转基因技术，提高转基因的效率。在此之前，浮萍的转基因大多通过愈伤组织侵染实现，但这种方法耗时长，效率低。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种浮萍活体原生质体制备方法。

本发明的目的是通过下述技术方案予以实现的。

一种浮萍活体原生质体制备方法，按照下述步骤进行：

步骤1，调整Datko培养基的PH至5～6，于95～105kPa、120～125℃下进行高压灭菌；所述Datko培养基由水和下述浓度的化合物组成：

在所述步骤1中，高压灭菌至少20分钟。

步骤2，采集浮萍，将浮萍培养于步骤1所述的Datko培养基上，每周继代1～2次，得到浮萍植株；其中，培养条件为：温度18～25℃，光周期16～18小时/天，光强95～97μmol m^-2s^-1；

步骤3，在25～28℃下将步骤2中所述浮萍植株放入甘露醇溶液中至所述浮萍植株发生质壁分离；其中，所述甘露醇溶液中甘露醇的体积浓度为10～13％；

在所述步骤3中，将步骤2中所述浮萍植株放入甘露醇溶液中0.5～2小时。

步骤4，在酶解温度为23～27℃的条件下，用组织酶解液在黑暗条件下酶解步骤3所得的浮萍植株25～30min，每间隔10～15min吹打混匀一次，得到悬浮的浮萍活体原生质体；所述组织酶解液由去离子水和下述浓度的物质组成：

在上述技术方案中，在所述步骤1之前，制备Datko培养基母液，通过对所述Datko培养基母液进行稀释得到所述Datko培养基。

在上述技术方案中，将所述Datko培养基母液与水按照体积比为(2～3)：1000的比例进行混合，得到所述Datko培养基。

在上述技术方案中，在所述步骤4之后，对所述浮萍活体原生质体清洗2～3次。

在上述技术方案中，通过离心对所述浮萍活体原生质体进行清洗：用20～25℃的A液体垂直打入浮萍活体原生质体所在离心管，以使所述浮萍活体原生质体悬浮，进行离心，离心后移除上层清液；所述A液由去离子水和下述物质组成：

在上述技术方案中，相对离心力为1800～2000×g。