[发明专利]细胞损伤修复蛋白在毕氏酵母中的诱导表达、纯化方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白表达技术领域，特别涉及人源蛋白在毕氏酵母中的诱导表达技术领域，具体是指一种细胞损伤修复蛋白rhMG53(TRIM72)在毕氏酵母中的诱导表达方法、纯化方法及其应用。

背景技术

有关细胞膜的损伤与修复研究要追溯到18世纪20年，Wilson等发现，多细胞生物的细胞膜损伤后细胞仍然能够存活[1]，但由于当时研究手段及设备落后，直至1958年，Heilbrunn等研究发现，在一定生理浓度的Ca2+存在下，细胞质内的囊泡迅速的在细胞膜损伤位点聚集，参与损伤细胞膜的修复，他们推测，当没有或低Ca2+时，胞质将从损伤位点不断外溢而导致细胞死亡[2]，具体机制了解的非常有限。后来，Bi和Miyake&McNeil等发现，细胞膜损伤活化了Ca2+依赖的胞内囊破的外泌，从而大量囊泡聚集在损伤位点，介导膜的修复[3,4]。而Morinoto等发现，突触结合蛋白Ⅰ(synaptotagminⅠ)是Ca2+感应器，从而诱发含有乙酰胆碱的囊泡外泌而聚集于细胞膜损伤位点[5]。随后根据细胞膜修复机制研究的结论提出了两种假设即：细胞膜张力的减少和修补复合物的形成。细胞膜张力的减少归功于膜损伤诱导内膜系统的外泌，包括细胞膜中PIP2介导的细胞骨架与细胞膜的粘附，细胞膜断裂而活化Ca2+活化的肌动蛋白切割/解聚酶，从而介导皮质肌动蛋白微丝的重排与解聚而减少膜张力，促进膜修复[6,7]；修补复合物的形成是在膜断裂位点Ca的迅速增加，更大囊泡的聚集及部分细胞器的参与如卵黄颗粒的参与[8,9]。

另外，参与细胞膜修复的外泌囊泡隔间及细胞器包含有皮质颗粒，卵黄颗粒，溶酶体及Enlargosomes等[2,10,11]。目前，也已经鉴定了部分蛋白参与细胞膜的修复调控机制。桥粒连接蛋白(Desmoyokin/AHNAK)是蛋白激酶B(PKB)的底物，定位于质膜面向胞质的一面，细胞膜的断裂诱导的胞外分泌将AHNAK从胞内转到胞膜外，具体功能还不清楚。SNARE蛋白被认为是膜修复过程中内膜融合的关键调控分子，定位于参与膜断裂修复的囊泡内，该蛋白家族由三十多位成员组成，在许多哺乳动物体内均有表达[2,12]。

TRIM72(又称Mitsugumin 53或MG53)是一种新发现的、在骨骼肌和心肌特异性表达的三重基序(Tripartite motif,TRIM)家族蛋白，它由一个RING finger、两个B-box motif、一个coiled-coil region和羧基端的一个PRY-SPRY结构域构成[13]。Takeshima等于2005年通过免疫蛋白质组学方法首次克隆MG53基因，之后采用生物化学和RNA杂交等方法研究发现MG53主要表达在骨骼肌细胞和心肌细胞内，然而通过遗传学方法敲除MG53并没有明显影响动物的行为和生育能力，随后，Ma JJ博士实验室研究发现，MG53^-/-小鼠在下坡跑练习中，与正常小鼠相比，其骨骼肌和心肌由于缺乏质膜修复能力而受到严重损伤。Cai等研究发现，在不同细胞中MG53的过表达，增加胞内囊泡向质膜运输，出现丝状伪足样结构。因此，推断含MG53囊泡可能参与质膜急性损伤后修复补丁的形成，随后一系列研究显示，MG53是细胞膜修复机制中的关键蛋白分子。与此同时，来自Young-Gyu Ko’s实验室的独立实验，采用比较二位电泳分析肌小管细胞系C2C12的抗去垢剂脂质筏鉴定了MG53在细胞膜损伤的修复过程中发挥重要的作用[14]。细胞膜修复是一个非常保守而复杂的过程，目前已报道，dysferlin、annexin、caipain、驱动蛋白ⅡA、非肌肉肌球蛋白ⅡB及MG53等多个蛋白参与这一过程。大多数细胞膜损伤的修复都是由钙离子向膜损伤部位聚集而触发，是一个主动过程。细胞膜的破损，导致定位于膜间质的磷脂酰丝氨酸转移至受损的膜表面，与MG53结合，然后与细胞内囊泡及细胞膜结合，破损的细胞膜诱使囊泡向膜破损处转运，转运至膜破损处后，MG53通过氧化低聚化的形式联接，最终在钙离子等相关因子的作用下细胞内囊泡与破损细胞膜融合完成细胞膜的修复[15]。MG53除了参与细胞膜损伤的修复之外，还能增加信号转导通路中与存活相关的蛋白激酶如Akt、GSK3β、ERK1/2的磷酸化水平，激活PI3K-Akt-GSK3β和ERK1/2信号转导，随后激活心脏的缺血预适应保护中的重要信号通路RISK信号通路而不是SAFE途径，因此，TRIM72在细胞膜损伤修复，心肌缺血/再灌注诱导损伤中具有重要的临床应用价值[16]。近期多篇文章报道，重组人源TRIM72(rhTRIM72)对细胞膜损伤具有保护作用，而且对缺血诱导肌肉、心脏、脑、肺、肾脏损伤也有明显的保护作用[17-22]。