[发明专利]一种人肠道病毒株及其应用

说明书

本发明公开了一种人肠道病毒株及其应用，本发明提供了一种EV71病毒减毒株，可在沙鼠原代肌肉细胞上获得稳定较高的病毒滴度。病毒减毒株157‑11‑2具有较好的免疫保护效果，为今后疫苗的研发提供良好的候选毒株。

(一)技术领域

本发明涉及一种肠道病毒EV71型减毒株及其应用。

(二)背景技术

近年来，我国手足口病(Hand,foot and mouth disease,HFMD)疫情呈蔓延上升趋势，手足口病报告发病例与死亡人数均居丙类传染病首位，2014年我国手足口病发病数达约282万余例，死亡人数508人，比2013年增长了近一倍，手足口病已成为中国主要的公共卫生安全威胁之一。肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)属于小RNA病毒科肠道病毒属肠道病毒A型，是手足口病的主要病原之一，EV71病毒感染可以引发心肌炎、脑干脑炎、无菌性脑膜炎、肺炎和类似于小儿麻痹的急性迟缓性麻痹等多种与神经系统相关的疾病，并且这些由EV71引起的神经系统并发症比其他肠道病毒引发的要严重，在台湾，由EV71感染导致的手足口患者重症病例中，有10％-25.7％的病例死亡，可见由EV71病毒感染引起的手足口病危害是相当大的。

我国虽然已经批准EV71疫苗上市，但市面上流通不广，长期大量人群的疫苗保护性和安全性有待观察；上市疫苗均为全灭活疫苗，需接种两次才能起到有效免疫保护效果，同时至今市面上也没有应用EV71减毒株作为其疫苗生产的报道。减毒活疫苗由于其显著的疫苗保护作用而被广泛的应用，目前大多数的病毒性疫苗都是减毒的活疫苗，如脊髓灰质炎，麻疹等减毒活疫苗，在全球病毒性传染病的防制中发挥重要作用。减毒活疫苗的研发也可以为增加目前上市疫苗的可靠性和安全性方面提供新的思路。近年来发现沙鼠对EV71的敏感性较强，21日龄的沙鼠对EV71亦完全敏感，可以作为较好的病毒感染动物模型，目前尚没有人应用沙鼠制备EV71病毒减毒株。

(三)发明内容

本发明的目的之一在于提供一株新的人肠道病毒株EV71/157-11-2(简称减毒株157-11-2)。

本发明的目的之二为提供一种利用减毒株157-11-2制备减毒活疫苗的应用。

本发明提供的减毒株157-11-2在原代沙鼠肌肉细胞中具有最佳的生长特性和适应特性，可以在较短时间内获得较高稳定的病毒滴度；同时利用该菌株制备的减毒活疫苗在动物体内具有良好的免疫保护效果。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一株新菌株-人肠道病毒株(Enterovirus)EV71/157-11-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2016年8月9日，保藏编号CCTCC NO：V201614，保藏地址中国，武汉，武汉大学，邮编430072。

本发明还提供一种所述人肠道病毒株EV71/157-11-2在制备EV71病毒减毒活疫苗中的应用，所述减毒活疫苗是指将人肠道病毒株EV71/157-11-2接种沙鼠肌肉细胞，共培养获得的培养液离心后的上清液。

进一步，所述减毒活疫苗制备方法为：待沙鼠肌肉细胞贴壁后弃培养液，接种人肠道病毒株EV71/157-11-2，轻轻摇动培养瓶使病毒与原代肌肉细胞接触均匀，37℃吸附2h后弃培养液，加入含3％血清的MEM培养液，37℃培养72-96h，待50％以上细胞出现细胞皱缩、变圆或脱落后，收集培养液，反复冻融3次，1000-2000×g离心20分钟，取上清液经0.22μm滤膜过滤，滤液与疫苗佐剂混合，即为减毒活疫苗。所述疫苗佐剂为终浓度0.6mg/ml氢氧化铝和终浓度0.5-1％(W/V)人血白蛋白。先在滤液中加入终浓度为0.6mg/ml氢氧化铝，轻摇溶解1h，按0.5-1％(W/V)比例加入人血白蛋白，即为减毒活疫苗。