[发明专利]一维磷酸钙纳米/微米材料及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种一维磷酸钙纳米材料及其制备方法和应用，该一维磷酸钙纳米/微米材料通过水溶性钙盐和水溶性磷酸盐通过微波辅助水热反应制得，该该一维磷酸钙纳米/微米材料为棒状结构，其长度为50nm‑500μm，长径比大于5：1，其可以与核酸混合后，将核酸递送到细胞内，其生物相容性好、基因转染效率高、持续时间长。

技术领域

本发明涉及基因载体技术领域，特别涉及一种一维磷酸钙纳米/微米材料及其制备方法和应用。

背景技术

基因治疗通过将外源基因导入到靶细胞核内以修复导致疾病的缺陷基因或者抑制导致疾病的有害基因，从而达到治疗疾病的目的。成功的基因治疗依赖于有效的基因载体，常见的载体分为病毒类载体和非病毒类载体。而病毒类载体因存在极大的安全隐患而限制了其发展。近年来，微环DNA(Minicircle DNA，mcDNA)的出现，成为基因载体中的一大亮点，微环DNA是一个环状的表达盒子，是通过DNA重组技术，把标准质粒的细菌骨架DNA去除后的产物，只含有一个基因表达框而没有外在的细菌骨架序列，其优点是能有效延长靶基因在细胞内的表达时间、携带的基因量大且几乎无毒性。但是由于裸露的DNA在生理环境中会被迅速清除，不能有效进入靶细胞，仍需合适的投递系统将微环DNA递送至靶向组织或器官。

常用的基因投递系统包括阳离子脂质体，阳离子多聚物(聚乙烯亚胺PEI)等。这类投递系统免疫原性较低、基因装载容量大，但是转染效率低，大大限制了其临床应用。因此，研究开发高效，具有良好生物相容性且具有靶向性的基因投递系统是解决基因药物临床应用的关键。

磷酸钙作为基因载体，生物安全性比较高，在很好的保护包裹DNA的同时，没有明显的细胞毒性。但一般存在粒径不可控、容易团聚、转染效率低等问题。但是磷酸钙-基因共沉淀法转染效率非常低(约10～20％)，制备的磷酸钙颗粒粒径大且难于控制，稳定性差，易团聚，难于用于体内转染研究。Leaf Huang等提出通过反相微乳法制备的磷脂双分子层包裹的DNA/磷酸钙纳米颗粒系统，但对磷酸钙的纯化步骤较繁琐，制备过程使用的阳离子脂质体具有较高的细胞毒性，且磷脂材料价格昂贵，不利于进一步临床应用。

发明内容

有鉴于此，本发明通过微波水热合成法制备了一维磷酸钙纳米/微米材料，其具有较大的长径比(其为纳米棒或具有尖端的针状物)，所述一维磷酸钙纳米/微米材料与微环DNA混合后，经腹腔注射，可以在小鼠腹腔内高效转染。可以作为高效转染的基因载体。

第一方面，本发明提供了一种一维磷酸钙纳米/微米材料的制备方法，包括以下步骤：

(1)将水溶性钙盐和水溶性磷酸盐分别溶于水中，配制得到水溶性钙盐和水溶性磷酸盐溶液，将所述水溶性钙盐和水溶性磷酸盐溶液加入到第一溶剂中，混合后得到第一混合溶液，其中，所述第一溶剂为水，或者水和醇的混合溶剂，所述醇包括乙醇、乙二醇和丙三醇中的一种或多种；

(2)调节所述第一混合溶液的pH值为5-11，将调节pH后的混合溶液置于微波水热釜中进行微波辅助水热反应，其中，反应温度为110-180℃，反应时间为10-60min；

(3)对反应后所得产物进行离心分离，并对分离出的固形物进行洗涤、干燥，得到一维磷酸钙纳米/微米材料。

优选地，所述水溶性钙盐为氯化钙和/或其水合物、硝酸钙和/或其水合物(Ca(NO₃)₂·4H₂O)、和/或乙酸钙和/或其水合物(Ca(CH₃COO)₂·H₂O)，但不限。

优选地，所述水溶性磷酸盐为磷酸铵、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、磷酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钾、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾等；，但不限于以上列举的可溶性无机磷酸盐。