[发明专利]一种基于针对特定基因反向互补序列和Py位点调控可变剪切的方法

说明书

本发明公布了一种基于针对特定基因反向互补序列和Py位点调控可变剪切的方法。具体是针对特定靶标基因可变剪切外显子上下游内内含子设计反向互补序列，并和Py位点一起构建进质粒中，通过反向互补序列与靶标基因配对，使其靶向定位，并通过Py区招募U2AF65蛋白和其他剪切因子，从而对靶标基因的可变剪切产生调节作用。本发明的方法可用于制备药物，在治疗由于可变剪切错误引起的人类疾病中有着极为重要的意义。

技术领域

本发明涉及生物学领域，具体地，涉及一种针对特定靶标基因设计其反向互补序列，将其与Py位点一起构建质粒，从而调控靶基因可变剪切的方法。

背景技术

可变剪切是前体mRNA通过不同的剪切方式，产生不同的剪切异构体的过程。可变剪切可以调节基因表达和蛋白质多样性，是导致真核生物和蛋白质多样化的重要原因。一些重要基因可变剪切的错误调节可以导致人类疾病。

真核生物的前体mRNA要通过一定的加工过程才能形成成熟的mRNA。这一过程包括5’端加帽，3’端加尾，以及去除内含子的剪接。成熟的mRNA与其他的蛋白质形成复合物转运出核在细胞质中进行翻译或降解。大多数前体RNA只有一种剪接形式，翻译成一种蛋白质。还有一些前体RNA在不同剪切位点间有好几种剪切形式，形成不同的剪切异构体，翻译成的蛋白质也不止一种，这个过程叫做可变剪切。

可以想象的是，这样高效的信息存储方式，出现的错误概率也会增加。而由于可变剪切发生错误而引起的人类疫病，都是非常严重的。据报道，如果把可变剪切的RNA异构体的相对含量改变，可能会引发疾病(Douglas,A.G et al.,2011；Havens,M.A et al.,2013)。例如，MAPT基因编码的tau蛋白是阿尔兹海默病的致病蛋白，对微管的组装和稳定起到重要的作用。在MAPT基因的10号外显子的调节元件中出现突变，会使得10号外显子的可变剪切降低，这样含有四个微管结合位点的tau蛋白异构体含量所占的比例就会上升，而含有三个微管结合位点的tau蛋白异构体含量所占的比例就会下降，这样会是的tau蛋白增加聚集，从而引起疾病。

在剪切和可变剪切中需要多种RNA和蛋白的共同作用，比如U2AF65。Py全称多聚嘧啶区(Polypyrimidine tract)，是一段多嘧啶区，可以通过蛋白U2AF65结合，在剪切过程中起着重要的调节作用。

发明内容

为了位点影响特异，本发明提供了序列特异性介导可变剪接的一种方法。

本发明所用的方法，是针对特定靶标基因可变剪切外显子上下游内内含子设计反向互补序列，并和Py位点一起构建进质粒中，通过反向互补序列与靶标基因配对，使其靶向定位，并通过Py区招募U2AF65蛋白和其他剪切因子，从而对靶标基因的可变剪切产生调节作用。这种方法可用于制备药物，在治疗由于可变剪切错误引起的人类疾病中有着极为重要的意义。

具体而言，本发明涉及以下各项：

1.一种用于调控靶标基因剪切的构建体，所述构建体包含Py位点和针对所述靶标基因的反向互补序列。

2.根据1所述的构建体，所述反向互补序列是针对所述靶标基因的可变剪切外显子的上/下游内内含子。

3.根据1所述的构建体，所述反向互补序列插入在所述Py位点3’端。

4.质粒，其包含1-3中任一项所述的构建体。

5.一种调控靶标基因剪切的方法，所述方法包括以下步骤：

1)将1至3中任一项所述的构建体或4所述的质粒转染入细胞；

2)提取RNA；

3)检测靶标基因的可变剪接的变化。

6.根据5所述的方法，其中，步骤3)中使用RT-PCR的方法检测靶标基因的可变剪接的变化。