[发明专利]一种诱导杜鹃兰原球茎芽簇增殖的方法

说明书

本发明公开了一种诱导杜鹃兰原球茎芽簇增殖的方法，该方法包括以下步骤：1)以杜鹃兰人工授粉的种子进行无菌萌发获得的原球茎为外植体；2)将原球茎置于1/2MS基本培养基中进行增殖培养；3)将增殖后的原球茎置于1/4MS基本培养基中诱导芽簇；4)将上述芽簇未分化与分化部分进行分割后置于不同培养基中进行芽簇增殖和分化出苗培养；5)将出苗植株置于1/4MS基本培养基中进行生根培养。取杜鹃兰组培苗进行炼苗并移栽到适宜其生长的基质中，直至长成健壮的杜鹃兰植株。本发明方法有效地提高了杜鹃兰种苗的繁殖系数，为实现其规模化生产奠定了基础。

技术领域

本发明涉及植物组织培养与快速繁殖方法，具体涉及一种诱导杜鹃兰原球茎芽簇增殖的方法。

背景技术

杜鹃兰[Cremastra appendiculata(D.Don)Makino]为兰科杜鹃兰属的野生珍稀药用植物，以其干燥假鳞茎入药。杜鹃兰假鳞茎含有生物碱、黄烷酮类、苷元、菲类等成分，内用具有抗肝癌、乳腺癌、子宫癌等功效，外用可治疮毒、蛇虫咬伤、皮肤烫伤或烧伤等。

杜鹃兰自然有性繁殖困难，在长期演化过程中适应了假鳞茎的营养繁殖，逐年产生的假鳞茎形成假鳞茎串，但每年仅由最新的假鳞茎发芽长成新植株、形成一个新假鳞茎，故繁殖系数极低。在人工种植中，可将假鳞茎串分株繁殖，虽在一定程度上提高了繁殖系数，但依然无法实现其规模化生产。通过人工授粉虽可获得种子，但其种胚败育，难以自然萌发成苗。加之人们长期的掠夺式采挖，导致杜鹃兰野生资源日渐枯竭，研究其有效的繁殖技术迫在眉睫。

发明内容

本发明提供了一种诱导杜鹃兰原球茎芽簇增殖的方法，该方法能够有效地提高杜鹃兰的繁殖系数，缩短其生长周期，为实现其工厂化育苗与药材规模化生产奠定了基础。

本发明采用的技术方案：首先以杜鹃兰种子无菌萌发获得的原球茎作为外植体材料，然后通过组织培养获得适于诱导芽簇的原球茎，再通过对基本培养基、蔗糖浓度、植物生长调节物质等的筛选及优化，建立原球茎诱导芽簇的适宜条件，最后以芽簇增殖培养批量生产试管苗，经炼苗、移栽，获得大量健壮的杜鹃兰植株。

具体步骤如下：

步骤1：采用人工授粉获得的杜鹃兰种子经培养基无菌萌发获得的原球茎为外植体；

步骤2：将步骤1中的外植体接种于原球茎增殖培养基上，置于温度15℃、光照时间12h·d^-1、光照强度2000 lx的光照培养箱内培养，40d后原球茎颜色由白色转为黄绿色，形成簇状原球茎且表面有白色毛状物；

步骤3：挑选步骤2中生长健壮的原球茎，以不含蔗糖1/4MS、1/2MS或MS为基本培养基，分别添加TDZ 1.5～2.5mg·L^-1+NAA0.1～0.3mg·L^-1+蔗糖10～30g·L^-1进行培养，培养温度为(25±2)℃，其他培养条件同步骤2，30d后原球茎分化形成芽簇；

步骤4：将步骤3中诱导形成的芽簇分割成两部分，一部分是芽簇中未分化的原球茎，将其接入步骤3中芽簇诱导培养基中继续诱导芽簇形成；另一部分是基部明显膨大且具有分化成苗趋势的原球茎，将其接入生根培养基进行生根培养，30d后形成具有3～5条长为2～3cm根的健壮杜鹃兰幼苗，培养条件同步骤3；

步骤5：将步骤4中成功诱导生根的健壮杜鹃兰幼苗转至炼苗室，3～5d后，打开封口膜取出幼苗，洗净幼苗根上附着的培养基，并吸干水分，然后用800倍多菌灵溶液浸泡其根5min，移栽到苗床上，喷水保湿，2个月后移栽上盆，即获得生长健壮的杜鹃兰植株。

作为优选方案，步骤3中选取生长健壮的原球茎，以不含蔗糖的1/4MS为基本培养基，外加TDZ 1.5mg·L^-1+NAA 0.3mg·L^-1+蔗糖20g·L^-1，培养温度为(25±2)℃。