[发明专利]一种林蛙皮透明质酸的提取方法

说明书

本发明提出了一种林蛙皮透明质酸的提取方法，包括：(1)获取林蛙皮粉；(2)利用蒸馏水对林蛙皮粉进行溶解；(3)将林蛙皮粉溶解液进行超高压处理；(4)利用胰酶和碱性蛋白酶对超高压浸出液进行酶解处理；(5)向酶解液中添加乙醇以便生成沉淀，离心收集沉淀并进行干燥处理；(6)利用氯化钠对经过干燥处理后的沉淀进行溶解；(7)向沉淀的溶解液中添加过氧化氢进行脱色；(8)调节pH至4.5‑5.0，并加入氯仿和正丁醇的混合溶液，离心分离出蛋白并收集水相；(9)对水相进行透析，收集透析液；(10)对透析液进行醇沉和干燥处理，以便得到透明质酸精品。该方法工艺简单，透明质酸提取率高、纯度高且活性好。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，本发明涉及一种林蛙皮透明质酸的提取方法。

背景技术

透明质酸(Hyaluronic acid，简称HA)是一种由β-D-N-乙酰基葡萄糖和β-D-葡萄糖醛酸为结构单元以β-1，4-糖苷键缩合而成的二糖单元，二糖单元再由β-1，3-糖苷键反复交替连接形成HA链。HA链长度最高可达25，000个二糖单元，相对分子质量在10⁴-10⁷道尔顿之间。

HA在医药、食品和化妆品等领域具有广泛的应用，具有独特的保湿性能。它可以作为伤口愈合，促进术后粘连作用，可以作为原始材料合成具有抗炎、止痛等作用的新药。由于HA分子中含有的大量羧基和羟基，可与水形成氢键而具有很强的保水能力。因此，HA被当做天然的保湿因子广泛应用到化妆品中。

目前可以通过动物组织提取和微生物发酵生产两种方式得到HA，由于目前微生物发酵生产机制尚未成熟，正处于研究阶段，而动物组织提取操作简单，方便，因此适合小规模的生产需要。HA广泛存在于动物的组织、器官中，如鸡冠、牛眼玻璃体、人的脐带以及蛙皮等中含有较多的透明质酸。

中国林蛙(Rana Chensinensis)是一种集药用、食补、美容三种兼容的经济动物。中国东北的林蛙多被制成“哈士蟆油”，其中林蛙皮即林蛙躯干表明的皮肤就作为蛤蟆油的副产品，每年数百吨林蛙皮被废弃或者作为饲料用。林蛙皮中含有大量的胶原蛋白、氨基酸以及透明质酸等活性物质，具有良好的应用价值。因此，从林蛙皮中提取透明质酸具有明显的优势，将提升我国对林蛙产业的经济效益。

目前，从林蛙皮中提取透明质酸的研究甚少，其提取工艺研究也不明确。沙坤等从林蛙皮中提取HA工艺是：通过蛋白酶初步酶解，经过氯仿除去蛋白质，再经过二次酶解，最后用季铵盐进行纯化后用超滤膜超滤进行脱色。这个方法是传统的制备HA的方法，缺点的是：步骤繁琐，造成HA提取率低；同时用了氯仿和季铵盐等多种有毒物质对人和环境不友好。张辉等通过陶瓷膜过滤法从林蛙皮中分离提取HA，只采用单一酶胃蛋白酶水解之后，选择一定孔径的陶瓷膜过滤除杂蛋白，HA提取率不高。

因此，目前对于从林蛙皮中提取透明质酸的工艺有待进一步改进。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种从林蛙皮中提取透明质酸的方法，该方法工艺流程简单，提取率高且提取纯度高、活性好。

根据本发明的一个方面，本发明提出了一种从林蛙皮中提取透明质酸的方法，包括：

(1)获取林蛙皮粉；

(2)利用蒸馏水对所述林蛙皮粉进行溶解，以便得到林蛙皮粉溶解液；

(3)将所述林蛙皮粉溶解液在超高压容器内进行超高压处理，以便得到超高压浸出液；

(4)利用胰酶和碱性蛋白酶对所述超高压浸出液进行酶解处理，以便得到酶解液；

(5)向所述酶解液中添加2-3倍体积的95％乙醇以便生成沉淀，离心收集沉淀并进行干燥处理；

(6)利用氯化钠对经过所述干燥处理后的沉淀进行溶解；