[发明专利]一种提高谷氨酸棒杆菌氨基酸产量的方法及其应用

说明书

本发明提供一种提高谷氨酸棒杆菌氨基酸产量的方法，包括如下步骤：1)获取谷氨酸棒杆菌基因组规模代谢网络模型中所需的反应数据、代谢物数据和注释的基因数据，构建谷氨酸棒杆菌基因组规模的代谢网络模型，验证所述谷氨酸棒杆菌基因组规模的代谢网络模型的准确性；2)根据步骤1)中验证后的谷氨酸棒杆菌基因组规模代谢网络模型预测提高氨基酸产量需要对应调节的代谢通量及代谢通量的调节方式；3)根据所述需要调节的代谢通量及代谢通量的调节方式结合注释的基因数据确定靶基因，对靶基因进行遗传改造，构建工程菌。还提供了该方法在提高L‑脯氨酸产量上的应用，实验证明L‑脯氨酸产量有很大提高。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体来说涉及一种提高谷氨酸棒杆菌氨基酸产量的方法及其应用。

背景技术

目前，微生物在解决人类的粮食、健康、资源和环境保护等问题中发挥重要且不可替代的作用。在现代发酵工业生产中，所有的原始菌种均需采用育种技术进行改良，以大幅度地提高发酵生产效率，降低发酵生产成本。20世纪90年代中期提出的代谢工程(Metabolic engineering)又称途径工程(Pathway engineering)，其定义为：“利用重组技术，对细胞的酶促反应、物质运输以及调控功能进行遗传操作，进而改良细胞生物活性的过程”，是对细胞内代谢途径网络系统分析的基础上进行有目的地改变，以更好地利用细胞代谢进行化学转化、能量转换合成和分子组装。

随着基因组及其相关技术的发展，几乎所有重要工业微生物模式菌株的全基因组序列都已经公布，微生物制造研究进入了后基因组时代。后基因组时代的微生物制造具有以下特点：1)源于微生物基因组的蛋白质组数据的积聚，使认识、理性设计、定向改变酶的性能更为容易；2)转录组学和代谢组学等数据的积聚有助于提高工业微生物抵御微生物制造过程中的恶劣环境的能力；3)从对微生物中个别基因或蛋白质功能的局部性研究，转移到以细胞内全部基因、mRNA、蛋白质以及代谢产物为研究对象的工业微生物生理研究；4)基于生物信息学的基因组规模基因调控网络、信号转导网络、蛋白质相互作用网络和代谢网络的构建、模拟与分析，逐步将代谢工程推入更为理性的系统代谢工程时代；5)采用合成生物学的技术精确控制代谢途径、合成目的蛋白，构建“人工细胞”，显著提高微生物制造效率。前已述及，由于基因与蛋白质倾向于成组地通过网状相互作用而影响微生物细胞功能，因此对工业微生物生理功能的理解和全局调控的研究必须构建并分析其相互作用的网络。这些分子和基因相互作用网络包括基因调控网络、信号转导网络、蛋白质相互作用网络和代谢网络等。其中，基于基因组注释的代谢网络将微生物细胞内所有生化反应构建为一个网络模型，反映了所有参与代谢过程的化合物之间以及所有催化酶之间的相互作用关系。

基因组规模代谢网络模型(Genome scale of metabolic model，GSMM)包含了所给定微生物细胞中发生的绝大部分生化反应。微生物细胞的代谢调控发生在基因-基因、基因-蛋白质、蛋白质-蛋白质、蛋白质-代谢物以及物理间相互作用等水平上。通过与其它组学数据，如转录组、蛋白质组等的整合，GSMM用以充分理解微生物细胞内的调控机制。因此，基因组规模代谢网络模型能提供一个高效平台，从全局水平理解微生物生理代谢功能。BIGG数据库表明，原核微生物的代谢网络包含了1000多个代谢物、1200多个基因和2000多个生化反应(以E.coli为例)；而真核微生物代谢网络模型包括1200多个代谢物、1000多个基因和1500多个生化反应(以S.cerevisiae为例)。基因组规模代谢网络模型一般包含约6％～15％(真核微生物)和25％(原核微生物)的开放阅读框(ORF)。目前，GSMM被广泛应用于定性与定量预测不同代谢或环境扰动条件下的细胞生长表型。包括：1)采用流平衡分析(Flux balance analysis，FBA)，预测不同营养物吸收速率、代谢副产物合成速率和细胞生长速率之间的全局性关系；2)预测不同类型培养基上细胞产率和比生长速率；3)基于基因-蛋白质-反应(Gene-protein-reaction，GPR)原则预测基因删除对细胞生长表型的影响；4)预测并构建微生物生长(或合成目标代谢产物)必需基因集；5)定量预测不同环境或代谢扰动下微生物的生长表型。