[发明专利]一种提高谷氨酸棒杆菌氨基酸产量的方法及其应用

权利要求书

1.一种提高谷氨酸棒杆菌氨基酸产量的方法在提高L-脯氨酸产量上的应用，其特征在于，

所述方法包括如下步骤：

1)获取谷氨酸棒杆菌基因组规模代谢网络模型中所需的反应数据、代谢物数据和注释的基因数据，构建谷氨酸棒杆菌基因组规模的代谢网络模型，验证所述谷氨酸棒杆菌基因组规模的代谢网络模型的准确性；

2)根据步骤1)中验证后的谷氨酸棒杆菌基因组规模代谢网络模型预测提高氨基酸产量需要对应调节的代谢通量及代谢通量的调节方式；

3)根据所述需要调节的代谢通量及代谢通量的调节方式结合注释的基因数据确定靶基因，对靶基因进行遗传改造，构建工程菌；

步骤3)中所述靶基因为putA和acn，所述遗传改造为在谷氨酸棒杆菌基因组中敲除putA基因和增强谷氨酸棒杆菌基因组中acn基因的表达，所述谷氨酸棒杆菌为含有定点突变的proB基因的谷氨酸棒杆菌，所述定点突变为将第149位的甘氨酸突变为天冬氨酸。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤1)中所需的反应数据包括运输反应、生物量反应、交换反应、糖代谢反应、氨基酸代谢反应、维生素和辅因子代谢反应、复合脂类代谢反应、核苷酸代谢反应、脂类代谢反应、能量代谢反应、其它碳代谢反应。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述敲除putA基因的步骤包括：

1)以谷氨酸棒杆菌基因组为模板通过引物扩增所述putA基因的上游同源臂和下游同源臂，融合所述putA基因的上游同源臂和所述下游同源臂；

2)步骤1)中融合的所述上游同源臂和所述下游同源臂片段经EcoR I和HindⅢ双酶切后，与经同样双酶切处理的载体pK18mobsacB连接；

3)步骤2)中的连接产物转化大肠杆菌，在含卡那霉素的培养基中筛选阳性转化子并验证，获得重组载体pK18mobsacB-ΔputA；

4)将重组载体pK18mobsacB-ΔputA转化谷氨酸棒杆菌，通过在含卡那霉素的培养基中正向筛选得到重组载体pK18mobsacB-ΔputA整合至染色体上的菌落，通过在含蔗糖的培养基中反向筛选，得到发生第二次同源重组的菌落并验证，获得敲除putA基因的重组菌CG413。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤1)中以P15和P16为引物PCR扩增putA基因启动子上游同源臂，以P17和P18为引物扩增putA基因下游同源臂，引物序列分别如下：

P15：5’-CCCAAGCTTGGTCAATGTCGGTGATGATCCT-3’

P16：5’-CCATGCGCAAAACGAGGTGGTTCTCCTTCAAGATCAG-3’

P17：5’-TGAAGGAGAACCACCTCGTTTTGCGCATG-3’

P18：5’-ACGCGTCGACACGGTCACGCCGTGCTCCA-3’。