[发明专利]体外培养富集CD8+T细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种体外培养富集CD8+T细胞的方法，更具体地，本发明涉及一种使用刺激物从人体外周血单个核细胞中大量定向扩增CD8+T细胞的方法。

背景技术

2011年，癌症超过心脏病，成为全球第一大死亡原因。WHO在2013年12月公布，全球每年新增癌症患者数已经超过1400万名，这与2008年的统计结果1270万人相比，人数大幅增加。同期，癌症患者的死亡人数也有所增加，从过去的760万人增加到820万人。报告称，到2030年，新增癌症病例将增加50％，达到每年2160万人。2013年免疫抗癌疗法被Science杂志评为年度10大科技突破之首。自2013年以来，肿瘤细胞及免疫疗法不断获得突破性进展，临床研究也取得了巨大成功，是当前肿瘤治疗领域最具前景的治疗手段，有望成为继手术、放化疗方法后的新的常规治疗方法。

细胞免疫治疗目前已经广泛开展，在早期的LAK细胞治疗尝试，后来发展到CIK(Cytokine Induced Killer Cell)、DC-CIK细胞治疗等。CIK细胞由IFN-γ，IL-2及anti-CD3抗体(OKT3)刺激后分化产生，其中在第0天加入1,000IU/ml的IFN-γ，24小时后加入50ng/ml OKT3和300IU/ml IL-2，中间间隔2天加入含IL-2的新鲜培养基，之后经过2-3周的培养可得到CIK细胞。CIK细胞主要包括三个亚群，CD3+/CD56+NKT细胞，CD3+/CD56-T细胞和CD3-/CD56+NK细胞。NK细胞通过非特异性表面受体(如FcγRIII，CD16)发挥ADCC效应识别并杀伤肿瘤细胞，经过体外培养的T细胞能够保持其TCR特异性识别特异性靶细胞发挥杀伤功能，而CD3+/CD56+CIK细胞是CIK细胞发挥肿瘤杀伤功能的主要细胞亚群，其通过细胞表面表达的NKG2D分子识别肿瘤细胞表面的MHC相关配体A/B(MIC A/B),实现对肿瘤细胞的非HLA限制性杀伤。CD3+/CD56+CIK细胞与终末分化的CD8+T细胞表型较为接近，被认为是从CD8+T细胞分化而来。目前研究认为CD3+/CD56+CIK细胞是CIK细胞中发挥肿瘤杀伤作用的主要细胞亚群，因此其比例也常作为CIK指控的重要参考指标。CIK的三类细胞亚群主要通过非特异性杀伤功能达到一定的肿瘤杀伤作用，作为早期肿瘤或肿瘤术后辅助治疗手段，在临床研究中对于提高病人的生存质量做出了一定的贡献。

肿瘤特异性CTL细胞是体内杀伤肿瘤细胞的直接效应细胞，通过细胞表面的TCR识别肿瘤细胞表面呈递的肿瘤抗原和HLA分子复合物，激活CTL细胞内一系列反应，通过分泌穿孔素、颗粒酶等直接杀伤肿瘤细胞。近年来科学家们研究了肿瘤突变产生的新表位对机体抗肿瘤作用的影响，有望推动肿瘤特异性T细胞治疗技术的进步和临床应用。现有临床研究表明，肿瘤组织处肿瘤特异性突变，尤其是免疫原性区域抗原的突变，能够产生新的、肿瘤特异性抗原，这些抗原能够激发体内特异性T细胞免疫反应，产生的T细胞表面TCR亲和力较高，从而有效发挥肿瘤细胞杀伤功能。然而肿瘤组织处的免疫耐受环境限制了特异性T细胞的有效激活和功能发挥，需要体外环境下实施人为干预，对突变抗原特异性T细胞进行体外扩增和活化。

在T细胞分化过程中，T细胞经历T细胞、效应性T细胞、效应性记忆性T细胞和中枢记忆性T细胞的不同时期，其分化增殖的能力各不相同，在免疫细胞治疗过程中，终末分化的T细胞由于其分化增殖能力相对较差，而中枢记忆性T细胞能够快速反应并且能够大量增殖，对于肿瘤等的治疗具有更加持久的作用时间，因此，T细胞培养过程中产生的中枢记忆性T细胞分群对于后期免疫细胞治疗效果具有重要意义。

T细胞分化过程中，其细胞表面标识发生逐渐变化，表现为CD45RA由阳性逐渐变为阴性，而CD62L逐渐由阴性变为阳性，双染色分析表现为：细胞表征为CD45RA+/CD62L+；效应性T细胞表征为CD45RA+/CD62L-；效应性记忆性T细胞表征为CD45RA-/CD62L-；中枢记忆性T细胞表征为CD45RA-/CD62L+。