[发明专利]一种基于鲤鱼上皮瘤细胞EPC的鳜鱼传染性脾肾坏死病毒ISKNV的增殖方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于鲤鱼上皮瘤细胞EPC的鳜鱼传染性脾肾坏死病毒ISKNV的增殖方法。所述增殖方法为：培养EPC细胞系；用ISKNV感染EPC细胞，恒温培养后收集培养液上清；再用培养液上清中的ISKNV感染EPC细胞，重复操作2～3次，ISKNV毒种复壮后，取培养液上清液氮保存，作为ISKNV扩增毒种；用复壮后的ISKNV毒种感染EPC细胞，恒温培养至CPE>80％，收集上清液，获得ISKNV病毒粒子。本发明以EPC细胞系作为ISKNV感染的敏感细胞，EPC细胞系商品化程度高，易于获得，容易培养，并且和鳜鱼的亲缘关系较远，可大大降低ISKNV用于灭活疫苗时的纯化难度，减少不良反应。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及了一种基于鲤鱼上皮瘤细胞EPC的鳜鱼传染性脾肾坏死病毒ISKNV的增殖方法。

背景技术

鳜传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus，ISKNV)于1998年从鳜鱼中分离出来。该病毒在细胞质内复制与组装，直径为150nm，是细胞质双链线状DNA病毒。ISKNV对鳜鱼、石斑鱼、大黄鱼等多种海淡水养殖鱼类的致死率极高，是危害我国养殖鱼类最严重的病毒病之一。ISKNV能感染鳜鱼脾、肾、肝、鳃、脑、性腺、心脏和消化道等组织器官，脾、肾为其主要感染器官。感染实验表明ISKNV能够通过四种方式感染宿主：(1)肌肉注射；(2)划痕浸泡；(3)腹腔注射；(4)口服。四种感染方式均可导致鳜鱼发病且死亡，但前三组死亡时间在10天左右，第四组则需20天。此外，温度对ISKNV的感染有影响，24-32℃是其适合的流行温度，当温度降到20℃时，鳜鱼脾肾坏死病并不发生大规模爆发。

ISKNV感染范围广，垂直传播+水平传播的感染，使得鳜鱼养殖病害频发，经济损失巨大。目前没有针对性的鱼用药物，疫苗免疫是目前控制该病的唯一有效途径，所以ISKNV病毒的大量扩增技术，纯度要求对于灭活疫苗的生产尤为重要。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的不足，目的在于提供一种基于鲤鱼上皮瘤细胞EPC的鳜鱼传染性脾肾坏死病毒ISKNV的增殖方法。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：

一种基于鲤鱼上皮瘤细胞EPC的鳜鱼传染性脾肾坏死病毒ISKNV的增殖方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)EPC细胞的培养：将EPC细胞接种于培养基，培养至细胞长成单层，细胞数量>10⁶/mL；

(2)ISKNV毒种的制备：取EPC细胞，向其中加入含ISKNV病毒的感染液，恒温培养后，收集培养液上清；

(3)ISKNV毒种的复壮：另取EPC细胞，向其中加入收集的培养液上清，用培养液上清中的ISKNV病毒感染EPC细胞，恒温培养后，再次收集培养液上清；重复此步骤2～3次；

(4)ISKNV毒种经多次复壮后，取培养液上清液氮保存，作为ISKNV病毒扩增毒种；

(5)利用ISKNV病毒扩增毒种感染EPC细胞，恒温培养至细胞裂解比例>80％，收集上清液，ISKNV病毒粒子即存在于所述上清液中。

上述方案中，步骤(1)所述培养基为含10％(质量浓度)胎牛血清的M199培养基。

上述方案中，步骤(1)中EPC细胞的培养时间为2～3天。

上述方案中，步骤(2)所述感染液还含有2％(质量浓度)胎牛血清。

上述方案中，步骤(2)所述感染液为含有2％(质量浓度)胎牛血清和ISKNV病毒的M199培养基。

上述方案中，步骤(2)和步骤(3)中所述恒温培养的温度为25℃，时间为8～12天。