[发明专利]一种基于鲤鱼上皮瘤细胞EPC的鳜鱼传染性脾肾坏死病毒ISKNV的增殖方法有效
| 申请号： | 201610536389.0 | 申请日： | 2016-07-08 |
| 公开（公告）号： | CN105950571B | 公开（公告）日： | 2019-08-23 |
| 发明（设计）人： | 周伟东;邓平;喻运珍;喻婷;张立强;周勇;徐洪亮;艾桃山;林蠡;周裕和 | 申请（专利权）人： | 武汉市农业科学院 |
| 主分类号： | C12N7/00 | 分类号： | C12N7/00;C12R1/93 |
| 代理公司： | 湖北武汉永嘉专利代理有限公司 42102 | 代理人： | 乔宇;徐晓琴 |
| 地址： | 430065 湖北*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 培养液 毒种 鳜鱼传染性脾肾坏死病毒 增殖 感染 复壮 恒温培养 皮瘤细胞 鲤鱼 生物技术领域 鳜鱼 病毒粒子 灭活疫苗 敏感细胞 亲缘关系 液氮保存 重复操作 上清液 扩增 商品化 | ||
1.一种基于鲤鱼上皮瘤细胞EPC的鳜鱼传染性脾肾坏死病毒ISKNV的增殖方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）EPC细胞的培养：将EPC细胞接种于培养基中，培养至细胞长成单层，细胞数量>106/mL；
（2）ISKNV毒种的制备：取EPC细胞，向其中加入含ISKNV病毒和2%胎牛血清的感染液，恒温培养后，收集培养液上清；所述恒温培养的温度为25℃，时间为8~12天；
（3）ISKNV毒种的复壮：另取EPC细胞，向其中加入收集的培养液上清，用培养液上清中的ISKNV病毒感染EPC细胞，恒温培养后，再次收集培养液上清；重复此步骤2~3次；所述恒温培养的温度为25℃，时间为8~12天；
（4）ISKNV毒种经多次复壮后，取培养液上清液氮保存，作为ISKNV病毒扩增毒种；
（5）利用ISKNV病毒扩增毒种感染EPC细胞，恒温培养至细胞裂解比例>80%，收集上清液，ISKNV病毒粒子即存在于所述上清液中；所述恒温培养的温度为25℃，时间为5~6天。
2.根据权利要求1所述的基于鲤鱼上皮瘤细胞EPC的鳜鱼传染性脾肾坏死病毒ISKNV的增殖方法，其特征在于，步骤（1）所述培养基为含10%胎牛血清的M199培养基。
3.根据权利要求1所述的基于鲤鱼上皮瘤细胞EPC的鳜鱼传染性脾肾坏死病毒ISKNV的增殖方法，其特征在于，步骤（1）中EPC细胞的培养时间为2~3天。
4.根据权利要求1所述的基于鲤鱼上皮瘤细胞EPC的鳜鱼传染性脾肾坏死病毒ISKNV的增殖方法，其特征在于，步骤（2）中所述感染液为含有ISKNV病毒和2%胎牛血清的M199培养基。
5.根据权利要求1所述的基于鲤鱼上皮瘤细胞EPC的鳜鱼传染性脾肾坏死病毒ISKNV的增殖方法，其特征在于，对步骤（5）收集的上清液进一步离心后取上清液，所述上清液中ISKNV病毒粒子的含量>109/mL。
6.根据权利要求5所述的基于鲤鱼上皮瘤细胞EPC的鳜鱼传染性脾肾坏死病毒ISKNV的增殖方法，其特征在于，所述离心的转速为12000rpm。
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