[发明专利]面包小麦Gli-D2-null位点优异等位变异的创制及其应用

说明书

本发明涉及面包小麦Gli‑D2‑null位点优异等位变异的创制及其应用。具体而言，本发明涉及一种小麦谷物，所述小麦谷物具有缺失或降低表达的Gli‑D2位点的α/β醇溶蛋白基因和/或其表达产物。本发明还涉及由所述谷物加工获得的产品、本发明的小麦用于产品加工的用途、产生本发明小麦的方法，以及获得醇溶蛋白优异等位变异蛋白的方法。本发明显著提高了谷醇比，提高了小麦面团品质和面包的烘焙品质，对面粉的加工品质具有明显的正向作用。

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及缺失α/β醇溶蛋白基因的Gli-D2位点纯合家系GD2N的创制，及开发的AS-PCR特异引物，及其在改良小麦加工品质方面的应用。

背景技术

小麦是全球最重要的粮食作物之一，世界上约有35％的人口以小麦面粉食品为主食，因此小麦品质、产量等性状的基础与遗传改良研究备受各国政府和科研究人员的重视。我国小麦的种植面积、总产及消费量均居世界首位。

小麦面粉中面筋蛋白决定面团的加工品质，已知小麦面粉中含有50多种不同的面筋蛋白，它们决定了面团的揉混特性和稳定特性，进一步决定了面包的烘焙特性(Shewry,P.R等,1990年)。这些蛋白根据溶解特性分为麦谷蛋白和醇溶蛋白，其中，根据迁移率大小麦谷蛋白又分为高分子量麦谷蛋白亚基和低分子量麦谷蛋白亚基；醇溶蛋白分为ω、γ和α/β醇溶蛋白。麦谷蛋白亚基通过分子间的二硫键聚合成稳定的大聚体蛋白，而醇溶蛋白主要则聚合分子内的二硫键形成单体蛋白。高分子量麦谷蛋白亚基被广泛的研究，因为它的等位变异和组成直接影响到面包的烘焙质量。虽然醇溶蛋白占面筋蛋白的50％以上，但它在面团加工过程中的作用仍然不能像高分子量麦谷蛋白亚基一样明确。醇溶蛋白由多基因家族编码，成簇状遗传，醇溶蛋白对面团品质的贡献很难予以研究(Piston,F.等,2011年)。

α/β醇溶蛋白由普通小麦(Triticum aestivum,AABBDD，2n＝6x＝42)第6同源染色体短臂上的Gli-2位点编码，即Gli-A2、Gli-B2、Gli-D2。α/β醇溶蛋白约占总醇溶蛋白含量的50％到60％，可以说α/β醇溶蛋白是面筋蛋白中最多，也是变异最大的一类面筋蛋白。α/β醇溶蛋白中的HLA-DQ2.5限制性抗原表位Glia-α1a(PFPQPQLPY)、Glia-α1b(PYPQPQLPY)、Glia-α2(PQPQLPYPQ)、Glia-α3(FRPQQPYPQ)和HLA-DQ8，限制性抗原表位Glia-α1(QGSFQPSQQ)、HLA-DQ8.5Glia-α1(QGSFQPSQQ)，经过脱酰胺作用之后成为烈性刺激物激活特异性CD4+T细胞，诱导后产生强烈的适应性免疫响应，是诱导乳糜腹泻病主要过敏原蛋白(Shewry,P.R等,2016年)。

不同蛋白组分行使不同功能，最终决定了面团的加工品质。利用突变体和基因沉默技术能够快速地了解未知基因的功能，是研究小麦的面筋蛋白功能的有效手段，如化学诱变技术(如EMS)，基因沉默技术(如RNAi)，基因定向编辑技术(如CRISPR/Cas9)等。然而，由于醇溶蛋白基因的高拷贝数、高度相似性和高重复序列等特点，化学诱变很难达到同一位点多个基因同时沉默的效果；在小麦中，利用RNAi技术降低醇溶蛋白含量，影响到面团的延展性，导致面包体积的减小；醇溶蛋白的降低显著降低了乳糜腹泻病抗原多肽，且显著提高了小麦面粉中的赖氨酸含量，增加了面粉的营养品质(Gli-Humanes,J.等,2014年)。α/β醇溶蛋白基因显著降低，导致其它类面筋蛋白的上升补偿效应，面团与对照相比无明显变化，面筋抗性增加，延展性轻微降低(Becker,D.等,2012年)。大幅降低醇溶蛋白含量，可能引起面团加工品质的显著下降，如烘焙面包的体积减小(Gil-Humanes,J.等,2012年；2014年)。而近年兴起的基因组编辑技术，如CRISPR/Cas9系统在敲除高拷贝基因时也存在诸多难题。

以上突变方法都很难创制出有效的并符合我国生产应用的醇溶蛋白座位缺失突变体。所以，为了研究某一座位醇溶蛋白的功能，有针对性的降低醇溶蛋白含量并对面团品质的影响具有较好的生产应用的现实意义。

参考文献