[发明专利]一种3‑氨基‑2‑恶唑烷酮免疫检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及含有呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-恶唑烷酮的检测方法及其应用。

背景技术

呋喃唑酮(痢特灵)是一种硝基呋喃类抗生素，为广谱抗菌药。3-氨基-2-恶唑烷酮(3-Amino-2-oxazolidinon,AOZ)是呋喃唑酮在动物体内的代谢物。呋喃唑酮可用于治疗细菌和原虫引起的痢疾、肠炎、胃溃疡等胃肠道疾患。对常见的革兰氏阴性菌和阳性菌有抑制作用。对毛滴虫、贾第鞭毛虫也有一定的活性。其作用机制为干扰细菌氧化还原酶从而阻断细菌的正常代谢。

人口服呋喃唑酮吸收率低，通过血液循环主要停留在肠道内。但该药物对肝、肾刺激大、易充血及发生体内糖代谢及神经病变作用，并可在体内残留。过量使用呋喃唑酮可能会导致胃肠道反应；溶血性贫血、皮疹、药热等过敏反应；多发性神经炎；新生儿和G-6-PH缺乏可致溶血性贫血。实验证明，硝基呋喃类药物及其代谢产物具有致癌和致突变的特性。

由于呋喃唑酮的毒副作用，各国政府都采取了相关管制政策。美国在1975年和1993年分别禁止了呋喃唑酮作为医药和兽药使用。日本在1977年禁止了呋喃唑酮的使用。2002年，中华人民共和国农业部将呋喃唑酮列为禁止使用的药物，不得在动物性食品中检出。中华人民共和国食品药品监督总局也于2002年禁止了硝基呋喃类(包括呋喃唑酮)在动物性食品中的使用。

但是，硝基呋喃类药物药效显著、价格低廉，能在动物体内迅速代谢从而难以检测。我国的养殖业中，仍有一些不法分子在利益的驱使下滥用了呋喃唑酮药物，对消费者的健康带来了极大的隐患，同时也严重损害了农产品进出口贸易。因此市场上急需一种高效快速灵敏的呋喃唑酮药物残留的检测方法。

由于酶联免疫吸附检测(ELISA)是一种具有突出优势的检测方法。该方法具有快速、简单、准确、高通量、无需专业操作等优点，使得它成为一种理想的市场监查检测方法。国家标准(GB/T 20752-2006，猪肉、牛肉、鸡肉、猪肝和水产品中硝基呋喃类代谢物残留量的测定)等的文献报道，把AOZ提取出来，在提取后用邻硝基苯甲醛作为衍生剂，与AOZ发生成肟反应从而生成NP-AOZ，但是NP-AOZ的酶联免疫吸附检测不够灵敏。

本发明创新地运用了一种呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-恶唑烷酮的检测方法，使得相应的ELISA检测灵敏度大幅度提高。因此，本发明建立的酶联免疫吸附检测方法可以大大提高检测准确性，为各层监督单位提供快速、高效、准确的检测方法，具有不可估量的市场价值。

发明内容

为了使得用于检测如动物源性食品及其加工产品等样品中AOZ残留的icELISA具有更高的灵敏度，本发明创新了一种3-氨基-2-恶唑烷酮的处理方法，使得icELISA更加高效更适宜于实际样品的检测。

本发明所述的3-氨基-2-恶唑烷酮免疫检测方法如下，将待测样品中的3-氨基-2-恶唑烷酮通过肟反应衍生得到3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-恶唑烷酮后进行酶联免疫吸附检测，以测定待测样品中的3-氨基-2-恶唑烷酮含量。

本发明中用3-醛基苯甲酸甲酯与待测样品中的3-氨基-2-恶唑烷酮发生肟反应。

本发明所述的酶联免疫吸附检测为间接竞争酶联免疫吸附(icELISA)测定。

本发明的待测样品的获取方法为将待检物与甲醇-水混合溶液混合研匀，离心后的沉淀物为待测样品。

本发明的待测样品肟反应的操作方法步骤包括：1)将沉淀物与盐酸溶液混合研匀；2)再与3-醛基苯甲酸甲酯混匀后旋干；3)再加入1,4-二氧六环在氮气保护条件下加热回流，减压旋转蒸发得到固体粉末；4)向步骤(3)的固体粉末中加入乙醇溶解；5)抽滤获取白色固体为含有衍生得到的3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-恶唑烷酮的物质。

本发明所述的酶联免疫吸附检测中用完全抗原AOZ-3-醛基苯甲酸-BSA免疫动物体获得抗血清。所述的酶联免疫吸附检测为基于上述抗血清的3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-恶唑烷酮间接竞争酶联免疫吸附反应。

本发明所述的酶联免疫吸附检测中以完全抗原AOZ-3-醛基苯甲酸-OVA作为固相抗原。

本发明所述的酶联免疫吸附检测中以3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-恶唑烷酮为竞争性抑制物，以抗血清为一抗，以IgG-HRP为酶标二抗。

本发明所述的3-氨基-2-恶唑烷酮免疫检测方法的应用，尤其在于将待测样品中的3-氨基-2-恶唑烷酮通过肟反应衍生得到3-醛基苯甲酸甲酯-3-氨基-2-恶唑烷酮后进行酶联免疫吸附检测在3-氨基-2-恶唑烷酮快速检测试剂盒方面的应用。