[发明专利]一种团头鲂外周血白细胞分离和原代培养方法

说明书

本发明涉及一种团头鲂外周血白细胞分离和原代培养方法，属于动物外周血白细胞分离和培养领域。其包括动物强化培养、血液收集、白细胞分离和培养等步骤：按照常规方法在无菌环境中抽取一定量鱼血，然后采用Percoll梯度离心的方法分离血液中外周白细胞，将所得细胞进行洗涤纯化，并放在适宜温度中进行培养；所述步骤中，以改良的RPMI‑1640培养液作为培养基，配置不同浓度的Percoll分离液，细胞在培养温度27℃、95%湿度、5%CO₂环境中进行原代培养2h以上即可贴壁生长。采用本发明能够获得团头魴生长良好的外周血白细胞。

技术领域

本发明涉及一种团头鲂外周血白细胞分离和原代培养方法，属于动物外周血白细胞分离和培养领域。

背景技术

团头鲂 (Megalobrama amblycephala)，隶属于硬骨鱼纲，鲤形目，鲤科，鲌亚科，鲂属。具有肉质嫩滑，味道鲜美，营养丰富，容易饲养，成活率高等特点，深受养殖者和消费者喜爱。2015年总产量达70多万吨，且呈逐年增长的趋势，是中国主要的淡水养殖品种之一。它目前养殖面积已遍布我国20余省，受到当地养殖者的喜爱和欢迎，并取得了较好的社会效益和经济效益。

细胞是动物的结构和功能的基本组成单位，利用培养的细胞作为试验材料已经广泛应用到环境毒理学、鱼类肿瘤学、生理学、内分泌学、遗传学和资源保护等方面。除此之外，由于近年来水产养殖业中病害频发，鱼类细胞培养技术越来越多地应用于水产动物病害防治领域，主要为：1、鱼类病毒学：鱼类细胞培养技术广泛应用于鱼类病毒的分离、鉴定以及病毒疫苗的制备；2、营养免疫学：分离鱼类免疫细胞，离体条件下使营养素对免疫细胞直接作用，这种方法可以快速、准确地发现营养素对细胞的免疫调控作用。此外，在研究过程中，使用原代培养细胞较使用细胞系进行试验的技术难度低、试验成本降低，同时也更接近鱼体自身生理条件，使试验结果更具说服力。

外周血白细胞是机体体液免疫和细胞免疫的重要组成部分，对研究机体免疫调节机制具有指导性作用。在白细胞分离与培养研究中，哺乳动物类白细胞需要外源刺激物（如白细胞介素）周期性的不断刺激才能达到体外长期培养目的，但是鱼类白细胞只需要一次或者不需要刺激，就可以保持体外长期增殖状态。目前有一些关于鱼类外周血白细胞分离与培养的论文，但是未见团头鲂外周血白细胞分离及原代培养方法的文献。因此本专利主要介绍团头鲂外周血白细胞分离与原代培养方法，为团头鲂原代白细胞分离培养提高参考。

发明内容

本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种团头鲂外周血白细胞分离和原代培养方法。

按照本发明提供的技术方案，一种团头鲂外周血白细胞分离和原代培养方法，步骤如下：

（1）强化培养：选取体质健康，体表无伤，体重100-250g的团头鲂，消毒后饲养于循环水系统中，每天3次投喂常规优质饲料15-20天；

（2）血液采集：随机抽取经过强化训练健康的团头魴进行麻醉，并用酒精棉球擦拭鱼体，进行尾静脉抽血；全血与含2000-3000U 肝素钠Heparin的RPMI-1640培养基稀释后备用；

（3）制备分离液：取若干已灭菌的15mL离心管，用过滤除菌的胎牛血清FBS润湿，依次用注射器小心加入3-5 mL 质量浓度45%-60%的硅胶颗粒混悬液Percoll和3-4 mL质量浓度10%-40%的Percoll溶液，保持界面清晰；

（4）分离纯化：取步骤（1）所得稀释液1-3mL，缓慢加到步骤（2）所得分离液上，在4-10℃，400-450g离心20-30min，然后小心从离心机中取出；用1mL注射器或移液枪收集在Percoll梯度界面1/3处的细胞，将收集的白细胞放入新的离心管中，重悬细胞；然后在4-10℃，400-600g离心 5-15min，倒掉上清，试管底部白色沉淀即为外周血白细胞，重复洗涤2-3次；