[发明专利]一种团头鲂外周血白细胞分离和原代培养方法

权利要求书

1.一种团头鲂外周血白细胞分离和原代培养方法，其特征是步骤如下：

（1）强化培养：选取体质健康，体表无伤，体重100-250g的团头鲂，消毒后饲养于循环水系统中，每天3次投喂常规饲料15-20天；

（2）血液采集：随机抽取经过强化培养的团头鲂进行麻醉，并用酒精棉球擦拭鱼体，进行尾静脉抽血；全血与含2000-3000U 肝素钠Heparin的RPMI-1640培养基稀释后备用；

（3）制备分离液：取若干已灭菌的15mL离心管，用过滤除菌的胎牛血清FBS润湿，依次用注射器小心加入3-5 mL 质量浓度45%-60%的硅胶颗粒混悬液Percoll和3-4 mL质量浓度10%-40%的Percoll溶液，保持界面清晰；

（4）分离纯化：取步骤（2）所得稀释液1-3mL，缓慢加到步骤（3）所得分离液上，在4-10℃，400-450g离心20-30min，然后小心从离心机中取出；用1mL注射器或移液枪收集在Percoll梯度界面1/3处的细胞，将收集的白细胞放入新的离心管中，重悬细胞；然后在4-10℃，400-600g离心 5-15min，倒掉上清，试管底部白色沉淀即为外周血白细胞，重复洗涤2-3次；

（5）原代培养：用RPMI-1640培养基重悬步骤（4）洗涤后的外周血白细胞，用移液管小心将细胞悬液转移到已灭菌的10mL的培养瓶中，其中含有3-4mL RPMI-1640培养基，并在27℃、95%湿度、5% CO₂环境进行培养2-4 h，即得所需贴壁的团头鲂外周血白细胞;

步骤（1）所述健康团头鲂要进行强化培养，具体培养方法如下：选取体质健康，体表无伤，体重100-250g的团头鲂，消毒后饲养于循环水系统中；所述养殖水恒温27℃，pH为7.2-7.8，溶解氧>5mg/L，氨氮<0.01mg/L；每天3次投喂常规饲料，饲养15-20天;

步骤（2）血液采集具体如下：随机抽取健康团头鲂用MS-222进行麻醉，后用质量浓度为75%的酒精棉球擦拭鱼体，置超净工作台中的托盘上，用2mL无菌注射器进行尾静脉抽血；按照全血与RPMI-1640培养基质量比为1-2：1-3的比例稀释，备用。

2.如权利要求1所述团头鲂外周血白细胞分离和原代培养方法，其特征是：所述步骤（2）RPMI-1640培养基中添加质量浓度5%-10 %的FBS、100 -150 U /mL青霉素、100-150U/mL链霉素和Heparin2000-3000U。

3.如权利要求1所述团头鲂外周血白细胞分离和原代培养方法，其特征是步骤（4）重悬细胞时，采用RPMI-1640完全培养基或含质量浓度5%-15%的新生牛血清、pH 7.4、0.01mol /L的PBS无菌磷酸盐缓冲液。

4.如权利要求1所述团头鲂外周血白细胞分离和原代培养方法，其特征是：所述质量浓度为10%-40%和45%-60%的Percoll溶液的配制方法为：取2.0-6.0mL的Percoll，加入1.5mol/L的NaCl溶液1-2mL，Heparin1500-2000U，再加入蒸馏水3-16mL，充分混合。

5.如权利要求1所述团头鲂外周血白细胞分离和原代培养方法，其特征是：所述分离液配制过程中，高浓度Percoll溶液在低浓度Percoll溶液下方，且高浓度Percoll溶液体积大于或等于低浓度Percoll溶液，同时需保持界面清晰。

6.如权利要求1所述团头鲂外周血白细胞分离和原代培养方法，其特征是：步骤（5）中，细胞培养2-4 h后细胞贴壁，后应及时给细胞换液，再培养24h获得纯化后的白细胞。