[发明专利]针对CTLA4的单域抗体及其衍生蛋白

说明书

技术领域

本发明涉及医药生物领域，公开了针对CTLA4的单域抗体及其衍生蛋白。具体而言，本发明公开了一种CTLA4结合蛋白及其用途，特别是在治疗和/或预防CTLA4相关疾病例如肿瘤中的用途。

背景技术

骆驼或是羊驼等骆驼科动物能够产生一种天然缺失轻链的重链抗体，其分子只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的CH2与CH3区，但却具有完整的抗原结合功能，而且不像人工改造的单链抗体片段(scFv)那样容易聚集。更重要的是，重组表达的单独的VHH结构域具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及抗原结合活性，是目前己知的可结合靶抗原的最小单位，被称作纳米抗体(Nanoboy)或重链单域抗体。重链单域抗体因其特殊的结构性质，兼具了传统抗体与小分子药物的优势，克服了传统抗体的开发周期长，稳定性较低，保存条件苛刻等缺陷，代表了新一代抗体治疗开发的方向。

肿瘤细胞表达的肿瘤相关抗原是产生有效的免疫应答的基础。然而当抗原与抗原递呈细胞(APCs)表面的主要组织相容复合体(MHC)分子结合并递呈抗原后，还需要共刺激信号来促进效应T细胞的活化。研究表明，很多肿瘤能够逃逸患者本身的免疫系统，部分原因是由于缺乏共刺激信号而无法充分活化T细胞，也很可能是由于肿瘤细胞通过调节性T细胞(Treg)诱导的免疫抑制导致的。抗原递呈细胞上的CD80或CD86与T细胞上的CD28结合是一个关键的共刺激信号。人细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)是T细胞上表达的负调控因子，与CD80和CD86具有更高的亲和力，其在阻断CD28的共刺激信号同时，激活T细胞负调控通路。CTLA4的免疫抑制效果在限制自身免疫应答的过程中发挥重要作用。然而在肿瘤免疫应答中，CTLA4介导的抑制机制则往往成为肿瘤细胞逃逸免疫系统的原因之一。因此，可以通过阻断CTLA4与CD80或CD86的相互作用来增 强T细胞介导的抗肿瘤反应。

本领域需要能够与CTLA4高亲和力结合，并且能够阻断CTLA4与CD80结合的抗CTLA4抗体，特别是抗CTLA4重链单域抗体。

发明概述

本发明的发明人利用噬菌体展示技术，通过筛选得到了具有高特异性、高亲和力和高稳定性的抗CTLA4重链单域抗体(VHH)。

在第一方面，本发明提供了一种CTLA4结合蛋白，其包括特异性结合CTLA4的免疫球蛋白单一可变结构域。

在另一方面中，本发明涉及编码CTLA4结合蛋白的核酸分子以及含有所述核酸分子的表达载体和宿主细胞。

本发明还涉及包含本发明的CTLA4结合蛋白的药物组合物。

本发明还涉及制备本文所述CTLA4结合蛋白的方法。

本发明还涉及本发明所述CTLA4结合蛋白以及药物组合物的应用，尤其是预防和/或治疗与CTLA4相关的疾病的用途和方法。

附图说明

图1.示出CTLA4重链单域抗体对CTLA4-Fc抗原蛋白的结合曲线。

图2.示出CTLA4重链单域抗体对CD80与CTLA4相互作用的阻断曲线。

图3.CTLA4重链单域抗体Fc融合蛋白对CD80与CTLA4相互作用的阻断曲线。

图4.示出抗体株C27的5种人源化变体(A)以及抗体株C1的4种人源化变体(B)的序列比对结果。

图5.示出CTLA4单域抗体Fc融合蛋白对CTLA4的结合曲线(ELISA法)。

图6.示出CTLA4单域抗体Fc融合蛋白对CTLA4的结合曲线(ELISA法)。

图7.示出CTLA4单域抗体Fc融合蛋白对CTLA4-CD80相互作用的阻断曲线(竞争ELISA法)。

图8.示出四价CTLA4单域抗体Fc融合蛋白对CTLA4的结合曲线(竞 争ELISA法)。

图9.示出二价以及四价CTLA4单域抗体Fc融合蛋白对CTLA4/CD80相互作用的阻断能力(细胞中和实验)。

图10.流式细胞仪检测CTLA4单域抗体Fc融合蛋白对CTLA4蛋白结合的特异性。

图11.示出四价CTLA4单域抗体Fc融合蛋白对猴CTLA4蛋白的结合。

图12.示出CTLA4单域抗体Fc融合蛋白对PBMC的激活作用。

图13.比较二价以及四价CTLA4单域抗体Fc融合蛋白对PBMC的激活作用。

图14.示出CTLA4单域抗体Fc融合蛋白对CD4+T细胞的激活作用。