[发明专利]一种低血清培养猪肺炎支原体培养基及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，涉及一种低血清培养猪肺炎支原体培养基及其制备方法和应用。

背景技术

猪支原体肺炎又称猪气喘病，是由猪肺炎支原体引起的一种接触性慢性呼吸道传染病，广泛存在于世界各地。猪只感染后除导致饲料转化率降低、生长发育不良外，且易继发病毒或细菌感染，造成猪死亡率升高，导致经济损失惨重。疫苗免疫是预防本病最重要的手段。

目前，培养猪肺炎支原体活疫苗的培养基主要有1975年Goodwin等发明的Friis培养基，2006年农业行业标准中提出的A₂₆培养基，以及江苏省农科院发明的KM₂培养基等。

南京天邦生物科技有限公司，于2012年发明的一种低血清高效培养猪肺炎支原体培养基及其制备方法，初步解决了培养基及其培养工艺在培养猪肺炎支原体168株存在的所用动物血清过多易引起过敏反应，降低血清中外源病毒或其他微生物会加大猪肺炎支原体活疫苗培养的风险。

在以上所有培养基及培养方式上，仍然需要进一步降低血清的使用剂量，甚至无血清培养基的高效培养方式，才能达到目前的培养需求。

发明内容

解决的技术问题：本发明提供一种低血清培养猪肺炎支原体培养基及其制备方法和应用，能够降低培养猪肺炎支原体所需的血清用量，达到传统培养基的培养效果。

技术方案：一种低血清培养猪肺炎支原体培养基，由基础培养基和辅助培养基组成，其中基础培养基包括MEM3-4g、酵母粉1-2g、葡萄糖3-4g、蛋白胨6-8g、0.5wt.%酚红溶液1-2mL、氯化钠1-2g、Na₂HPO₄·12H₂O0.5-1.0g、KH₂PO₄0.1-0.2g、去离子水400-600mL；辅助培养基包括酵母浸出汁30-60mL，20wt.%L-精氨酸溶液0.5-1mL，3wt.%谷氨酰胺溶液40-50mL，青霉素终浓度为100-300U/mL，灭活的猪血清40-100mL；所述基础培养基还含有氯化钾0.1-0.5g；所述辅助培养基还含有0.01g/mL胆固醇甘油溶液5-10mL、10wt.%甘氨酸溶液0.5-1mL，10wt.%L-半胱氨酸溶液1-2mL；最后，将配置好的基础培养基和辅助培养基混合，并用1mol/L氢氧化钠溶液调整pH值至7.4-7.6。

上述方案中，以整体计每400mL培养基中加灭活的猪血清不高于40mL，即整体培养基中血清添加的体积比例小于10%。

上述0.01g/mL胆固醇甘油溶液的制备方法为：用0.1-0.5g胆固醇溶于10-50mL甘油内，并在116℃灭菌30min，冷却至37℃。

低血清培养猪肺炎支原体培养基的制备方法，按照下列步骤进行：a、制备基础培养基：将基础培养基的所有成分，搅拌均匀混合，全部溶解，在116℃灭菌30min，待冷却后备用；b、制备辅助培养基：将辅助培养基的成分过滤除菌，混合搅拌，既得辅助培养基；c、将高压冷却灭菌好的基础培养基和辅助培养基混合，用过滤除菌的1mol/LNaOH调节pH值7.4-7.6，分装备用。

上述培养基在培养猪肺炎支原体中的应用。

有益效果：1、本发明制备的猪肺炎支原体培养基，在培养肺炎支原体时可以降低培养基中血清的使用量，达到传统培养基的培养效果，并能减少动物应激反应。

2、本发明制备的猪肺炎支原体培养基，用CCU方法测定该培养基制备的菌液效价达到10^8-9/mL，在培养基原料种类及成本上明显优于KM₂培养基，达到培养猪支原体肺炎弱毒活疫苗（168株）的生产要求。

具体实施方式

下面的实施例可使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。在不背离发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

1、制备基础培养基：