[发明专利]一种同时检测N-MID和β-CTX的双标记时间分辨荧光免疫分析方法

说明书

技术领域

本发明具体涉及一种同时检测N-MID和β-CTX的双标记时间分辨荧光免疫分析方法。

背景技术

骨质疏松是指骨量减少和骨的微结构的改变，导致骨的脆性增加，易发生骨折的代谢性疾病，骨骼疼痛、易于骨折为特征。骨质疏松症是一种年龄相关性疾病，人口老龄化程度越高，患病人数越多。我国至少7000万人口患有骨质疏松症，2.1亿人骨量低于正常标准，多发于处于生长发育期的青少年、妊娠期妇女、绝经期妇女和老年人中。因此，对骨质疏松患者的骨密度和骨代谢的生化指标进行研究，对全面了解骨骼代谢状态，预测骨折发生的危险性，指导临床治疗有十分重要的意义。

骨代谢生化指标包括反映成骨细胞活性的骨形成指标和反映破骨细胞活性的骨吸收指标。骨钙素(BGP) 属于γ-羧谷氨酸包含蛋白类，此蛋白类为维生素K依赖性，主要由成骨细胞产生和分泌，其生理功能是维持骨的正常矿化速度，可直接反映骨形成的状况。血液标本放在室温下1小时后，骨钙素即会大量降解，其降解产物骨钙素N端中分子片段（N-MID）因其良好的稳定性和重复性，可代替骨钙素反应骨形成的状态。在骨基质的有机成分中，I型胶原的含量超过90%，受骨基质合成和分解的调控。在骨代谢的过程中成熟的I型胶原被降解成小分子片段进入血循环，并通过肾脏进行排泄。通过检测骨吸收指标，可了解骨转换的程度。β胶原降解产物（β-CTX）是反映I型胶原分解的特异性指标，当I型胶原结构、含量及稳定性发生异常，导致骨转换加快，I型胶原降解短肽片段进入血液循环，β-CTX明显升高，是世界上公认的代表骨吸收的标志物，检测血清β-CTX适用于监测骨质疏松症或其它骨疾病的抗吸收治疗。

X射线骨密度测量仪测量骨密度因其无创伤性、敏感性和客观性成为骨质疏松症诊断的金标准，但其不能反应短时间内骨吸收和转移的改变而具有一定的局限性。生化检测具有简便、快捷、无创伤性等优点，在流行病学、长期跟踪随访及其预防性诊断方面具有明显优势。针对骨钙素的定量检测，市场上有酶联免疫吸附法和化学发光法为原理的定量检测试剂盒，但因骨钙素在血液中的不稳定性，使其检测的意义大打折扣；I型胶原作为骨基质的主要有机成分，只有降解后才能进入血液循环，故而没有针对I型胶原的生化检测方法。而针对单一成分N-MID和β-CTX的检测产品，市场上只有广州菲康生物技术有限公司生产的“骨钙素N端中分子片段检测试剂盒（酶联免疫法）”和“血清β-胶原降解产物检测试剂盒(酶联免疫法)”。只检测一种组分的方法以及试剂盒虽然从技术上来说更简单而且成本更低，但是其精确性和特异性等方面存在一定风险。

目前市面上还没有针对两种成分N-MID和β-CTX同时检测的产品。

发明内容

本发明的目的是建立一种敏感性高、快速、简便、易于临床推广的、以同时检测N-MID和β-CTX水平的双标记TRFIA-ELISA定量检测试剂盒及其制备方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种同时检测N-MID和β-CTX的双标记时间分辨荧光免疫分析方法，包括下列步骤：

1)固相抗原的制备：分别将N-MID和β-CTX的偶联抗原用包被缓冲液稀释至1～5μg/ml，包被酶联板，并用封闭液封闭；

2)镧系元素离子标记抗体的制备：分别采用不同的镧系元素离子标记N-MID或β-CTX抗体，分离纯化；

3)测定方法：在步骤1）制备的含有两种偶联抗原的酶联板上，每孔依次加入N-MID和β-CTX的标准品或者待测样品，补加分析缓冲液，室温震荡反应，洗涤液洗涤后，加入以分析缓冲液稀释的步骤2）制备的不同的镧系元素离子标记的N-MID或β-CTX抗体，室温震荡反应后，洗涤液洗涤，最后加入增强液进行荧光检测。

优选的，步骤1）中N-MID抗原为人工合成骨钙素中部第20-43位氨基酸组成的肽段，其氨基酸序列为 SEQ ID NO：1所示。

优选的，步骤1）β-CTX抗原为人工合成I型胶原al链C末端8个氨基酸序列的肽段，其氨基酸序列为 SEQ ID NO：2所示。

优选的，步骤1）中所述的包被缓冲液为50mmol/L、pH 9.6的碳酸盐缓冲液；封闭液为1%的OVA溶液。所述包被缓冲液是经过研发得到的最优选择，如果选择其他的缓冲液，如市售普通缓冲液，其效果都不如本发明选择的缓冲液效果好，比如信号弱，特应性和灵敏度都稍低。

优选的，步骤1）中利用鸡卵白蛋白OVA作为载体蛋白偶联N-MID和β-CTX抗原。OVA蛋白作为载体蛋白是最优选择。