[发明专利]一种同时检测N-MID和β-CTX的双标记时间分辨荧光免疫分析方法

权利要求书

1.一种同时检测N-MID和β-CTX的双标记时间分辨荧光免疫分析方法，其特征在于，包括下列步骤：

1）固相抗原的制备：分别将N-MID和β-CTX的偶联抗原用包被缓冲液稀释至1～5μg/ml，包被酶联板，并用封闭液封闭；

2）镧系元素离子标记抗体的制备：分别采用不同的镧系元素离子标记N-MID或β-CTX抗体，分离纯化；

3）测定方法：在步骤1）制备的含有两种偶联抗原的酶联板上，每孔依次加入N-MID和β-CTX的标准品或者待测样品，补加分析缓冲液，室温震荡反应，洗涤液洗涤后，加入以分析缓冲液稀释的步骤2）制备的不同的镧系元素离子标记的N-MID或β-CTX抗体，室温震荡反应后，洗涤液洗涤，最后加入增强液进行荧光检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）中N-MID抗原为人工合成骨钙素中部肽段，其氨基酸序列为 SEQ ID NO：1所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）β-CTX抗原为人工合成I型胶原al链C末端肽段，其氨基酸序列为 SEQ ID NO：2所示。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）中所述的包被缓冲液为50mmol/L、pH 9.6的碳酸盐缓冲液；封闭液为1%的OVA溶液。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）中利用鸡卵白蛋白OVA作为载体蛋白偶联N-MID或β-CTX抗原。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2）中的N-MID或β-CTX抗体是通过合成N-MID或β-CTX，应用碳化二亚胺法将N-MID或β-CTX与BSA偶联后作为免疫原，进行小鼠免疫，制备和筛选单克隆抗体。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3）中所述的分析缓冲液为50mmol/L pH 7.8 Tris-HCl，每升含0.09% NaCl，0.02% BSA，0.05% Tween-20，0.05% NaN₃。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3）中所述的洗涤液为含0.9% NaCl的50mmol/L的Tris-HCl浓缩液，按照1：25倍稀释使用。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3）中所述的标准品系列浓度为N-MID：0，0.01，0.1，1，10，100ng/ml ；β-CTX：0，0.1，1，10，100，1000 pg/ml。

10.一种同时检测N-MID和β-CTX的双标记时间分辨荧光免疫分析试剂盒，由以下成分组成：包被有两种偶联抗原的固相酶联板、洗涤液、分析缓冲液、增强液、不同的镧系元素离子标记的N-MID和β-CTX抗体以及N-MID和β-CTX参考标准品，上述组分如权利要求1-9任一项所述。