[发明专利]一种β-葡萄糖苷酶的突变体W233D及其应用

说明书

本发明属于酶学技术领域，具体涉及一种β‑葡萄糖苷酶的突变体W233D及其应用。一种β‑葡萄糖苷酶的突变体W233D，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。它是通过将S‑bgl6的233位的色氨酸Trp，W突变成天冬氨酸Asp，D，改造得到的。这个突变体酶相对于突变前的酶具有更高的葡萄糖耐受性的功能。它在酶反应中的葡萄糖的耐受能力是突变前的209.9倍，对纤维二糖的水解能力与突变前的一致，能够在降解纤维二糖中应用。

技术领域

本发明属于酶学技术领域，具体涉及一种β-葡萄糖苷酶的突变体W233D及其应用。

背景技术

化石燃料的加速消耗及其对全球经济和环境的影响加速了人们对可替代燃料(如纤维素乙醇)的研究。纤维素乙醇是主要以木质纤维素类生物质为原料生产的燃料乙醇。木质纤维素是不同植物或作物中最丰富的成分，主要有由纤维素、半纤维素和木质素组成(Sorensen A,Lubeck M,Lubeck P S,et al.Fungal beta-glucosidases:a bottleneckin industrial use of lignocellulosic materials.Biomolecules,2013,3(3):612-631.)，其中纤维素占组成成分的50％左右。纤维素是一种有1000-10000个葡萄糖单体以β-1,4糖苷键连接的直链多糖，多个分子平行紧密排列成丝状不溶性微小纤维，其基本组成单位是纤维二糖，它是地球上最丰富的聚合体。

目前，主要有三种分解纤维素的方法：(1)化学法：酸解法、碱处理法和离子液处理法(李建华，张越，刘仲齐。化学处理方法对木质纤维素降解效率的影响评述。生物技术进展，2011，06：421-425.)。但是这些方法成本比较高，处理过程复杂而且含有较多对下一步发酵有影响的物质。(2)物理法：常用的为热裂解法与蒸汽爆破法。这些方法能源消耗高，对设备要求严格限制了其推广以及应用。(3)酶解法：酶解法具有反应条件温和、不污染环境，能源消耗少，反应产物单一等优点，符合环保经济的特征，值得作为分解纤维素生产燃料乙醇的推广方法。

而纤维素彻底降解为葡萄糖需要纤维素酶系的协同作用纤维素酶系包括：①外切-1,4-β-D-葡聚糖酶(exo-1,4-β-D glucanase或1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase，EC3.2.1.91，简称CBH)能够水解纤维素两端(还原端和非还原端)，每次切下一个纤维二糖，使紧密结合的纤维素晶体逐渐分解为单一的纤维素分子。②内切-1,4-β-D-葡聚糖酶(1,4-D-glucanohydrolase或endo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4，简称EG)能够随机水解单条纤维素中的β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截断，形成纤维素小分子，如：纤维二糖、纤维寡糖。③β-葡萄糖苷酶(β-D-glucosidase，EC 3.2.1.21，简称GE)能够将纤维素外切酶以及纤维素内切酶作用形成的纤维二糖和纤维寡糖水解，最终形成葡萄糖。

然而，在纤维素降解的过程中，β-葡萄糖苷酶虽然能够将纤维二糖水解为葡萄糖从而解除了纤维二糖对外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶的抑制作用，但葡萄糖的积累又可以通过阻断活性位点或阻止产物离开引起反馈抑制，从而降低了纤维素生物质水解过程的速率。在工业上用来消除葡萄糖的抑制的方法主要有：提高酶的使用浓度和用超滤方法转移累积的葡萄糖。这两种方法不可避免的会使生产成本提升，所以寻找一种提高β-葡萄糖苷酶的葡萄糖耐受性的方法是目前研究β-葡葡萄糖苷酶应用的热点之一。