[发明专利]一种构建验证视网膜感光细胞特异性表面蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，涉及视网膜细胞方面，具体涉及一种构建验证视网膜感光细胞特异性表面蛋白的方法。

背景技术

视网膜是组成视觉系统的关键结构。临床上，针对屈光性视觉功能障碍，已有有效的治疗方法，但对视网膜病变，尤其是外伤、变性等原因引起的视觉障碍或失明，目前仍束手无策。由于视网膜来源于神经外胚层，具有典型的中枢神经组织结构特点，对损伤敏感，且难以再生，使其成为难治性眼病的症结所在，也是眼科研究的重点、难点和亟待攻克的领域。多年来，国内外众多的研究人员为此开展了广泛的探索，国家科技部也分别于2005年、2007年和2012年分别设立了三个“973”项目予以攻关。此外，因结构明晰、功能清楚，且便于操作和观察，视网膜也是研究中枢神经结构、功能，乃至再生的重要窗口。

尽管一些低等动物的视网膜具有一定的再生能力，但一般认为哺乳类动物，尤其是灵长类动物的视网膜是不具有这种能力。因此，如何激发视网膜内在的再生潜能或通过外源性细胞的植入，以达到修复视网膜结构甚至功能，成为近10多年来的研究热点。

纵观近十年来的视网膜再生研究，在干细胞来源、干细胞诱导分化、动物模型制备及干细胞移植方式上已经取得了一定的进展，但仍存在诸多问题有待解决。

目前通过干细胞诱导分化所获得的视网膜细胞通常是多种细胞的混合，而视网膜疾病的发病早期多数仅累及一种细胞，因此，如果能够获得某种纯化的细胞，且在视网膜疾病的发病早期将纯化的细胞移植到体内，则可以从两个方面对患者的视觉功能进行改善：首先，移植的纯化细胞可以改善患者局部的微环境，从而有利于患者自身残存细胞的生存；其次，移植的纯化细胞可以部分替代受损细胞，从而改善患者的视觉功能。

细胞替代疗法治疗神经元退行性疾病首要解决的问题是细胞纯度的问题。其原因显而易见，首先，将诱导分化的细胞在体外进行药物筛选或功能鉴定时，混 杂的其它细胞将会影响结果的可靠性；其次，如果将混杂的细胞移植到模型动物体内，将会产生异常增生甚至致瘤的风险。虽然目前已经有很多研究致力于提高节细胞的诱导分化率，例如：将Math5转染到干细胞，然后通过FACS筛选来获得纯化的节细胞，然而，这些方法存在致命缺陷，即：将报告载体转染到干细胞内会导致干细胞基因组的改变，从而限制了其临床应用。

发明内容

本发明的目的在于一种构建验证视网膜感光细胞特异性表面蛋白的方法，从而找到感光细胞特异性表面蛋白，用于人胚胎干细胞/人多能干细胞来源的视网膜感光细胞的纯化，从而加快临床利用细胞移植替代疗法治疗人类视网膜相关疾病(如青光眼、黄斑性眼病等)。

本发明的具体技术方案如下：

一种构建验证视网膜感光细胞特异性表面蛋白的方法，包括如下步骤：

(1)利用Talen技术，建立Crx-GFP的人胚胎干细胞系，将这种Crx-GFP的人胚胎干细胞系诱导分化至第6周，通过FACS筛选，将表达GFP的感光细胞前体细胞筛选并纯化；

(2)应用BD公司的表面蛋白筛选试剂盒对该纯化的感光细胞前体细胞进行筛选，确定一种感光细胞表面蛋白；

(3)为了证实筛选获得的感光细胞表面蛋白是否仅仅表达在感光细胞上，将人胚胎干细胞诱导分化至第6周，利用FACS技术对该表面蛋白进行筛选，分别获得表面蛋白阳性和特异性表面蛋白阴性的细胞；

(4)证实筛选获得的感光细胞表面蛋白是否特异性的表达在感光细胞膜表面；

(5)确定筛选获得的感光细胞表面蛋白特异性的表达在感光细胞膜表面后，为了证实这种表面蛋白筛选获得的细胞在体外和体内是否具有功能，将步骤(3)中得到的细胞与色素细胞系ARPE-19进行共培养，如果得到的细胞可以成熟，则得到的细胞与色素细胞系ARPE-19共培养后，将会看到感光细胞的外节可以被色素细胞系所吞噬；

在确定了得到的细胞可以形成外节并被色素细胞所吞噬之后，利用RCS小鼠的动物模型，将得到的细胞移植到小鼠眼球视网膜下腔；观察小鼠的视觉功能是否有部分改善。如果得到的细胞具有功能，则该细胞移植后的一段时期内，通过一 系列功能学检测，我们将会看到小鼠的视觉功能有部分改善。

步骤(3)中，将获得的表面蛋白阳性和表面蛋白阴性的细胞培养2周后，分别进行如下鉴定：(1)是否形成外节；(2)通过电生理检测是否可以产生动作电位。