[发明专利]一种构建验证视网膜感光细胞特异性表面蛋白的方法

权利要求书

1.一种构建验证视网膜感光细胞特异性表面蛋白的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)利用Talen技术，建立Crx-GFP的人胚胎干细胞系，将这种Crx-GFP的人胚胎干细胞系诱导分化至第6周，通过FACS筛选，将表达GFP的感光细胞前体细胞筛选并纯化；

(2)应用BD公司的表面蛋白筛选试剂盒对该纯化的感光细胞前体细胞进行筛选，确定一种感光细胞表面蛋白；

(3)为了证实筛选获得的感光细胞表面蛋白是否仅仅表达在感光细胞上，将人胚胎干细胞诱导分化至第6周，利用FACS技术对该表面蛋白进行筛选，分别获得表面蛋白阳性和特异性表面蛋白阴性的细胞；

(4)证实筛选获得的感光细胞表面蛋白是否特异性的表达在感光细胞膜表面；

(5)确定筛选获得的感光细胞表面蛋白特异性的表达在感光细胞膜表面后，为了证实这种表面蛋白筛选获得的细胞在体外和体内是否具有功能，将步骤(3)中得到的细胞与色素细胞系ARPE-19进行共培养，如果得到的细胞可以成熟，则得到的细胞与色素细胞系ARPE-19共培养后，将会看到感光细胞的外节可以被色素细胞系所吞噬；

在确定了得到的细胞可以形成外节并被色素细胞所吞噬之后，利用RCS小鼠的动物模型，将得到的细胞移植到小鼠眼球视网膜下腔；观察小鼠的视觉功能是否有部分改善。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中，将获得的表面蛋白阳性和表面蛋白阴性的细胞培养2周后，分别进行如下鉴定：(1)是否形成外节；(2)通过电生理检测是否可以产生动作电位。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(4)中，为了证实筛选获得的感光细胞表面蛋白是否特异性的表达在感光细胞膜表面，对发育不同时期的人胚胎视网膜组织以及成年人视网膜组织进行表面蛋白的染色，观察筛选获得的感光细胞表面蛋白是否特异性地表达在感光细胞膜表面。