[发明专利]CK‑MB校准品稀释液及其在临床CK检测中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及医学检测试剂，特别是CK-MB校准品稀释液及其在临床CK检测中的应用。

技术背景

肌酸激酶(creatine kinase,CK)以二聚体的形式存在，在收缩组织高能磷酸键的产生和应用上具有重要作用。而且，在细胞浆内，线粒体产生的ATP通过磷酸肌酸传递到使用部位，肌酸激酶起到“穿梭运输”的作用。“穿梭假想”在一些组织得到证实，在肾脏远曲小管，尽管它并不收缩，但是需要大量ATP供给钠钾泵维持离子梯度。CK催化的化学反应为：肌酸(Creatine)+ATP在CK催化下生成磷酸肌酸(creatine phosphate,CP)和ADP。线粒体产生的ATP存储在CP中，经过转用到使用部位。

CK的分子量较大(>80kd)，不能通过肾脏排泄，一些研究表明CK是由网状内皮系统清除，如肝脏的网状内皮系统。总CK的升高可见于试验室分析的干扰、坏死组织的释放，总CK是骨骼肌、心肌损伤的非常敏感的指标，常见于各种骨骼肌损伤，一些临床药物如镇静药、抗抑郁药物可引起CK增高，蜜蜂叮咬等也可引起升高。杜氏肌营养不良患者早期轻度升高，在成人神经肌肉疾病也会升高。此时，心脏肌钙蛋白可作为不同来源损伤的鉴别指标。临床CK检查通过酶法检测，即检测CK催化磷酸肌酸转化的活性。

CK的同工酶，有四个基因编码CK亚基，M亚单位(19号染色体)，B亚单位(14号染色体)，另外2个线粒体亚单位。还有第5个B亚单位的假基因(16号染色体)。M和B亚单位结合形成三个同工酶CK-MM、CK-BB、CK-MB，分子量在86-89ku。尽管CK活性需要二聚体存在，各亚单位也存在催化活性。在不同组织，3种同工酶的分布是不一样的，骨骼肌组织(99％MM，1％MB)，心脏组织(77％MM，22％MB，1％BB)，脑组织(100％BB)，肠道、胃、膀胱等(0-6％MM、MB，92-96％BB)。由此可见，在不同的组织损伤产生的同工酶是不一样的。CK-MB同工酶问世后，一度成为AMI(Acute Myocardial Infarction，急性心肌梗死)诊断的“金指标”。同时，在血清中还存在CK的同工酶变异体，“巨大CK”1型、2型，尽管日常不检测它们，但是它们会影响CK-MB的检测，包括免疫抑制法和电泳法。

最早的检测CK-MB的方法是柱层析和电泳的方法，通过分离得到CK不同同工酶的条带。免疫抑制的方法最早开发于1975年，目前在全球广泛的使用。它是将M亚基的多克隆抗体抑制M亚基后，用传统的总CK方法检测剩余亚基的活性，由于BB亚基相对量少，可以忽略不计，CK-MM被完全抑制，CK-MB测定值为实际活性的一半，测定值乘以2就得到CK-MB的值。免疫抑制法的优点在于成本较低同时可以在生化分析仪上大量检测。缺点在于不特异，如果BB亚型增高会对结果产生较大影响，巨大CK也会对结果产生较大影响，甚至造成CK-MB超出总CK活性的情况。另外腺苷激酶(Adenylate kinase,AK)也会影响检测，AK在红细胞中含量较大，在溶血的标本，检测时AK会影响CK-MB的值。

由于CK-MB免疫抑制法的非特异性，临床常用它进行筛选，对于升高患者需要用其他方法来验证，在总CK<100U/L时，可以不用检测CK-MB，因为往往它们是正常的。这也适应于急性心肌梗早期，酶水平还没有升高的时候。同时通过CK指数(CK同工酶活性/总CK)可以间接判断CK来源，如CK-MB超出上限，而CK-MB/总CK<4％，往往是由于骨骼肌释放出来的可能性比较大；如CK-MB/总CK>25％，要考虑到CK-BB和巨大CK(1型和2型)的存在，因为AMI患者很少超出这个范围，如果在4％-25％，应该连续监测样本活性，诊断AMI的准确性>90％。

自从1960年以来，CK-MB成为AMI的金标准，不同的检测方法应用于临床，包括层析法、电泳法、免疫抑制法。然而，为了提高反应的特异性，缩短检测时间，开发出质量法(CK-MBmass)，单位ug/L,最高灵敏度为1ng/ml，比CK-MB特异，最小检测时间为7分钟。它使用双位点免疫分析技术，用抗M亚单位抗体、抗B亚单位抗体、抗MB特异性抗体检测抗原。它检测是抗原的量而不是活性，所以和CK总活性及CK-MB活性不同，不会受酶活力衰减的影响。