[发明专利]一种耐温，酸稳定的内切多聚半乳糖醛酸酶基因的克隆、定义及应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种能够分解聚半乳糖醛酸或果胶的耐温，酸稳定 的内切多聚半乳糖醛酸酶rEPG4的应用。

背景技术

果胶是复杂的多糖聚合体，其结构主要由部分甲酯化的D-半乳糖醛酸聚合而成。果胶 是植物中间层和细胞壁的重要组成部分，对促成植物组织结构及稳定性方面起着至关重要的 作用(VanBurenetal.,1991)。由于果胶结构的复杂性，所以果胶酶为一个复合酶体系。基 于酶的作用类型和对反应底物的偏好性，果胶酶可以分为原果胶酶、果胶甲酯酶、多聚半乳 糖醛酸酶和果胶裂解酶(Alkortaetal.,1998)。在这些复合酶中，内切多聚半乳糖醛酸酶能 够随机切割果胶聚合体中由非甲酯化的半乳糖醛酸残基所组成的α-1,4糖苷键，从而使高聚 合度的果胶发生解聚。这一特性使得内切多聚半乳糖醛酸酶是果胶酶的最重要组成部分。

碱性内切多聚半乳糖醛酸酶主要由细菌产出，并大量应用于造纸、纺织、废水处理、榨 油及咖啡和茶叶的发酵。酸性内切多聚半乳糖醛酸酶主要由真菌产出，其主要应用于果蔬和 果酒的澄清以及饲料的消化(Kashyapetal.,2001)。当前绝大多数商业果胶酶由黑曲霉产 出，并且来源于该菌的几个内切多聚半乳糖醛酸酶已经被报道，这些酶都属于酸性酶，然而 在温度高于50℃(Guoetal.,2002.Liuetal.,2014.Singhetal.,2002)，pH低于4.0条件下不稳 定(Liuetal.,2014)。不同的生物处理需要不同的生化环境，所以具有耐温，酸稳定的内切 多聚半乳糖醛酸酶，不仅能够提高其催化效率，而且也能够扩展其应用范围。与已经报道的 内切多聚半乳糖醛酸酶相比，rEPG4具有高效的催化活性以及优良的酸稳定性和热稳定性， 这些特征使得其具有很高的潜在应用价值。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种耐温，酸稳定的内切多聚半乳糖醛酸酶，记为rEPG4。

所述的耐温，酸稳定的内切多聚半乳糖醛酸酶rEPG4含有380个氨基酸，其序列如SEQ IDNO.1所示。

其中，所述的rEPG4的N端19个氨基酸为其预测的信号肽序列。因此，成熟的rEPG4有 361个氨基酸，序列如SEQIDNO.2所示。

所述的rEPG4的信号肽序列为SEQIDNO.3所示。

本发明克隆了这一内切多聚半乳糖醛酸酶基因，克隆得到的内切多聚半乳糖醛酸酶基因 记为epg4，DNA全序列分析结果表明：epg4结构基因含有5个内含子，全长1484bp，其序列 如SEQIDNO.4所示。

所述的rEPG4的cDNA全长1143bp，序列如SEQIDNO.5所示。

所述的rEPG4去除信号肽序列后的cDNA序列如SEQIDNO.6所示。

其中，所述的rEPG4的信号肽的cDNA序列如SEQIDNO.7所示。

含有上述DNA分子的克隆载体、表达载体、重组大肠杆菌或重组毕赤酵母也是本发明保 护的范围。

上述表达载体为在巴氏毕赤酵母Pichiapastoris中表达的pPIC9K载体。本发明的表达载 体具体为在pPIC9K载体的SnaBI和AvrII酶切位点间插入序列表中SEQIDNO.6核苷酸得到的 表达载体pPIC9K-repg4。

上述重组毕赤酵母为将所述表达载体pPIC9K-repg4导入巴斯德毕赤酵母中得到的重组菌 GS115/rEPG4。

上述的DNA分子、克隆载体、表达载体、重组大肠杆菌、或重组毕赤酵母在制备内切多 聚半乳糖醛酸酶rEPG4中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的另一个目的是提供一种制备内切多聚半乳糖醛酸酶rEPG4的方法，所述方法包 括以下步骤：

1)用pPIC9K-repg4重组载体转化巴斯德毕赤酵母PichiapastorisGS115，筛选得到重组 菌株GS115/rEPG4；

2)培养重组菌株，甲醇诱导重组内切多聚半乳糖醛酸酶基因epg4的表达；

3)回收并纯化所生产的内切多聚半乳糖醛酸酶rEPG4。