[发明专利]从外周血中分离富集血管内皮祖细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及血管细胞分离技术领域,特别涉及一种从外周血中分离富集血管内皮祖细胞 的方法。

背景技术

EPC(endothelialprogenitorcells，血管内皮祖细胞)是一类能循环、增殖并分化为 血管内皮细胞，但尚未表达成熟血管内皮细胞表型，也未形成血管的前体细胞。该细胞体外 培养的生理形态为鹅卵石样内皮细胞层，EPC鉴定的通用表面标记为：CD45(-)、CD34(+)、 KDR(+)、CD31(+)。

在来源于外周血的EPC细胞群被鉴定和描述后，在成体中的血管生成也开始被报道出来。 大量的文献报道都在着重强调EPC维持血管内皮完整性的重要性。其中EPC通过发挥旁分泌 效应促进血管生成和自身整合到新血管组织这两条途径来维持内皮的完整性。EPC的血液循 环数与心血管危险因子存在着一个反比关系。EPC在众多血管性疾病(血管创伤、脑卒中、 心血管疾病，糖尿病并发症等)的血管修复中起着重要的作用，同时EPC可用作产生组织工 程血管、人造心脏瓣膜以及癌症的治疗、基因治疗的载体。

随着科研人员对EPC(血管内皮祖细胞)在众多血管性疾病(血管创伤、脑卒中、心血 管疾病，糖尿病并发症等)的血管修复中起着重要作用的认识不断加深，如何获取快速获取 EPC成为了EPC基础研究和临床研究中首要解决问题。

从外周血中分离富集EPC的研究是一个研究EPC生物学特性、血管重建和血管生成非常 好的工具，同时对于研究EPC在成体中血管修复的机理是具有非常重要的临床应用价值。

现阶段中分离和富集EPC的步骤在不同文献报道中各不相同，分离效率、增殖潜能等多 个重要指标存在很大差异，且缺乏一个有效可比性的结果。较为通用分离富集方法为：采集 人新鲜外周血，从人体外周血中分离单个核细胞，再利用大致适合于EPC生长的的培养基培 养；根据细胞形态挑选EPC样的单个克隆，再利用表面标志物鉴定流式细胞分选、RT-PCR分 析、内皮细胞摄取Ac-LDL功能分析所得细胞是否为EPC。但不同课题组、不同文献报道(或 申请专利)的分离培养方案、培养基成分差异较大，所宣称的效果(细胞增殖潜能等)亦差 异巨大。

现阶段中由于分离和富集EPC的步骤在各团队中各不相同，且缺乏一个有效可比性的结 果。同时，由于各种分离培养条件选择的不同，包括血液的体积、处理时间、血液抗凝剂、 涂层机制和胎牛血清的比例等因素均会影响到分离富集的细胞的种类和数量。在对于EPC的 基础研究和临床研究当中，均没有一个统一的可以结果之间进行相互比较的分离富集方法。 同时，市场上得到广泛应用的EPC培养基EBM-2实际上是针对脐带血内皮祖细胞(HUVEC)的 分离培养而研制的，目前尚缺乏成熟可靠的成年人外周血内皮祖细胞专用培养基。

发明内容

为了解决以上现有技术在EPC分离中存在的分离效率、增殖潜能差别大的问题,本发明旨 在建立一个标准、通用、高效的从外周血中分离富集血管内皮祖细胞的方法，通过实验摸索 出的分离过程中的最优的条件，使得分离结果的各个指标之间具有可比性，解决分离细胞结 果不稳定的问题，提高分离富集细胞得率，用于EPC的细胞生理特性的基础研究和血管修复、 再生的临床应用。

本发明是通过以下措施实现的：

一种从外周血中分离富集血管内皮祖细胞的方法,包括以下步骤：

(1)获取待分离富集的外周血样(2小时内进行处理)，在离心管中颠倒混匀一次，用pH7.2 的PBS磷酸缓冲液1:1稀释得到稀释的血液，稀释时先向管中加入PBS磷酸缓冲液，再加入 外周血样；

(2)取4个50mL离心管，每个加质量/体积百分比浓度为3.5-5.0％的羟乙基淀粉溶液15mL， 在羟乙基淀粉溶液中缓慢加入20mL稀释的血液，确保稀释的血液留在羟乙基淀粉溶液上层， 室温375-425r/min，离心30-35min,结束后吸取中间白膜细胞层的单个核细胞液，约20mL， 每两管的吸取物合并为一管；