[发明专利]从外周血中分离富集血管内皮祖细胞的方法

权利要求书

1.一种从外周血中分离富集血管内皮祖细胞的方法,其特征在于包括以下步骤：

（1）获取待分离富集的外周血样，在离心管中颠倒混匀一次，用pH7.2的PBS磷酸缓冲液1:1稀释得到稀释的血液，稀释时先向管中加入PBS磷酸缓冲液，再加入外周血样；

（2）取4个50mL离心管，每个加质量/体积百分比浓度为3.5-5.0%的羟乙基淀粉溶液15mL，在羟乙基淀粉溶液中缓慢加入20mL稀释的血液，确保稀释的血液留在羟乙基淀粉溶液上层，室温375-425r/min，离心30-35min,结束后吸取中间白膜细胞层的单个核细胞液，每两管的吸取物合并为一管；

（3）取2个新管，每管加入15-20mL步骤(2)中得到的吸取物，分别用pH7.2的PBS磷酸缓冲液1:1稀释，室温275-325r/min，离心15-20min,弃上清,剩余物用1mL培养液重悬,培养液组成为每80mLEBM-2基础培养基中加入FGF20.1-0.2mL、VEGF0.1-0.2mL、IGF-10.1-0.2mL、BMP-40.1-0.2mL、LiF0.3-0.5mL和GA0.1-0.2mL；

（4）将8mL培养液加入其中一管，混匀后加入另一管，共10mL悬液；

（5）计数；

（6）胶原蛋白酶I铺细胞培养瓶：50μg/mL的胶原蛋白酶I105μL溶于0.02M的醋酸7.5mL，0.22μm过滤器过滤，铺于T75瓶，37℃1小时，室温1小时，10mLDPBS冲洗2次，加5mL培养液；将步骤（4）得到的10mL悬液注入，48h后半换液一次，操作为抽出7.5mL原培养液，新加入7.5mL培养液，此后每72h半换液一次，培养条件CO₂培养箱中37℃、CO₂浓度5%；

（7）传代：细胞增殖至细胞密度为90-100%时，传至3个培养瓶。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于传代10-15代。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2）中离心速度为390-410r/min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3）中离心速度为280-300r/min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2）中离心速度为380r/min，离心30min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3）中离心速度为280r/min，离心20min。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（5）中计数操作为取步骤（4）中的悬液10μL加入到490μL杜氏磷酸盐缓冲液DPBS中，混匀，从中取10μL计数，其中视野之内的4个大格细胞总数之和为N，总细胞数=10⁴×50×10×N/4。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于N≥35,总细胞数≥4.375×10⁷。