[发明专利]一种中国南海芋螺毒素编码序列，制备方法以及应用

权利要求书

1.南海新的蜡黄芋螺O-超家族毒素基因，其从中国南海蜡黄芋螺毒管中分离得到，其 特征在于，核苷酸序列如序列表<400>1所示。

2.一种由根据权利要求1所述的蜡黄芋螺O-超家族毒素基因编码的多肽，其特征在于： 含有权利要求1所述基因编码的氨基酸序列或其保守性变异多肽序列或其活性衍生物。

3.根据权利要求2所述的多肽，其特征在于：由所述基因编码的多肽的前体肽氨基酸序 列如序列表<400>2所示。

4.根据权利要求3所述的多肽，其特征在于：所述多肽的成熟肽片段的氨基酸序列如序 列表<400>3所示。

5.一种根据权利要求2～4任一所述的多肽的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)称取氯树脂1.5g于150ml的反应器中，用50ml的DCM浸泡；其中，所述氯树脂的取代 度为0.2mmol/g；

(2)经步骤(1)处理2h后，用DMF洗涤氯树脂，然后抽干，如此重复四次，将氯树脂抽干后 待用；

(3)称取苏氨酸(Thr)192mg于10ml的离心管中，加入5ml的DCM将其溶解，然后加入1ml 的DIEA振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反 应；

(4)经步骤(3)处理2h后，用一定量的甲醇封头半小时，然后用DMF洗涤四次，抽干待用； 其中，甲醇：DIEA:DCM＝1：1：2；

(5)向反应器中加入一定量的20％哌啶，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去氯树 脂上的Fmoc保护基团；脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干；其中，哌啶/DMF＝1:4；

(6)取少量氯树脂用茚三酮法检测，其中，检A、检B各两滴，100℃反应1min，氯树脂有颜 色，说明脱保护成功；

(7)称取281mg半胱氨酸和HOBT135mg于10ml的离心管中，加入5ml的DMF将其溶解，然 后加入0.5ml的DIC振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃ 的摇床中反应；其中，所述半胱氨酸的侧链特殊修饰C(a)；

(8)经步骤(7)处理1h后，取少量氯树脂检测，用茚三酮法检测，其中检A、检B各两滴， 100℃反应1min，若氯树脂为无色，说明反应完全；若氯树脂有颜色，说明缩合不完全，继续 反应；待反应完全后，用DMF洗涤氯树脂四次，然后抽干，向反应器中加入一定量的20％哌 啶，放在脱色摇床上摇晃20min,以此来脱去氯树脂上的Fmoc保护基团；脱完保护后用DMF洗 涤四次，然后抽干检测保护是否脱去；其中，哌啶/DMF＝1:4；

(9)按照步骤7-9依次接上

L,H,A,W,T,N,C(b),V,N,S,C(c),C(a),H,S,H,H,N,C(b),A,G,N,H,S,T,C(c),D，脱去D 的保护后，用切割试剂切割下肽链冻干；

(10)粗样品的氧化折叠，采用碘氧化法：将合成完裂解下来的安诺吉斯肽冻干后，用适 量水进行溶解；将新鲜配制的碘液逐滴加入到安诺吉斯肽溶液中，边加边搅拌，直至多肽溶 液呈现淡黄色；反应几分钟后，加入几滴新鲜配制的抗坏血酸溶液，淡黄色褪去，终止氧化。

6.由权利要求2、3、4所述的多肽用于离子通道类型的及亚型的分类鉴定检测以及神经 生物学工具药物和镇痛药物的应用。

7.根据权利要求所述的多肽，其特征在于，所述成熟肽段的分子量为3050.29道尔顿。

8.根据权利要求1所述的南海新的蜡黄芋螺O-超家族毒素基因，其特征在于，所述基因 编码93个氨基酸残基，成熟肽编码28个氨基酸残基。