[发明专利]一种体外人工分离淋巴细胞及冷冻保存的方法

权利要求书

1.一种体外人工分离淋巴细胞及冷冻保存的方法，其特征在于，包括 以下步骤：

A1、对淋巴细胞进行分离：

抽取10ml静脉血注入EDTA抗凝真空采血管，待血液与抗凝剂混合均 匀后，在3000rpm和室温下离心10分钟；

用第一塑料巴氏吸管吸取血样中上层淡黄色血浆作为自体血浆，然后 在EDTA抗凝真空采血管中加入1:1的特定培养液稀释血样；

取15ml的第一锥形离心管加入5mlFicoll-PaquePlus溶液，再将稀 释后的血样加在Ficoll-PaquePlus溶液上面,在400g加速度和室温下离 心30分钟；

用第二塑料巴氏吸管吸取第一锥形离心管中两层液体间的不透明细胞 层，获得淋巴细胞，转入第二锥形离心管；

在第二锥形离心管中加入4℃预冷的特定培养液，与淋巴细胞充分混 合，250g加速度下离心10分钟；

弃上清，重悬第二锥形离心管中的淋巴细胞于4℃预冷的特定培养液 中，重复洗涤两次，留取细胞悬液获得纯化的淋巴细胞；

A2、对纯化的淋巴细胞进行冷冻保存：

将第二锥形离心管中纯化的淋巴细胞重悬于3ml含10％DMSO和30％自体 血浆的冷冻保存液中；

将淋巴细胞转入冻存管中，4℃平衡10分钟，然后按照1℃/分钟的降 温速度进行降温，最后保存在-150℃的气态液氮罐中。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，计算活细胞百分率和淋巴 细胞回收率的方法如下：

依次在1、3、6、12、24、60个月后复苏冻存的淋巴细胞，取出冻存 管，迅速投入37℃水浴中，使冻存的淋巴细胞完全融解；

将冻存管中融解的淋巴细胞加入含10％FBS的完全培养基中，离心，弃 上清，重悬淋巴细胞于4℃预冷的特定培养液中；

从复苏后得到的PBMS细胞混悬液中取出10μl淋巴细胞悬液，并在淋 巴细胞悬液中加入0.4％台盼蓝染色液10μl；

3-5分钟后，取10μl淋巴细胞悬液与台盼蓝染色液的混合液加入到血 细胞计数板，置显微镜下观察；

根据正常细胞体完整、透明不着色以及死细胞呈蓝色的原理，随机计 数200个淋巴细胞，并计算活细胞百分率和淋巴细胞回收率。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，取冷冻保存处理前的细胞 悬液进行细菌和真菌培养。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，以均数±标准差表示计算 结果，采用SPSS13.0统计学软件分析数据。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述 活细胞百分率＝(活细胞数/总细胞数)×100％。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述活细胞百分率为 (97.0±0.5)％。

7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述淋巴细胞回收率＝(分 离后淋巴细胞数/分离前淋巴细胞数)×100％。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述分离前淋巴细胞数在 静脉采血后进行血常规检查得到；用A1中洗涤后末次细胞悬液涂片，进行 HE染色，区分PBMS细胞混悬液中各类型细胞并计数，得到所述分离后淋巴 细胞数。