[发明专利]一种提取川贝母DNA的方法

说明书

技术领域

本发明提供一种提取川贝母的DNA的方法，具体的说，是一种提取川贝母DNA的方法；属于化学检测技术领域。

背景技术

川贝母主要分布于四川、云南、西藏等地，品质较优，为百合科植物川贝母、棱砂、乌花等的鳞茎，具有清热润肺、化痰止咳的功效，药用价值较高。传统的川贝母的鉴别，主要是性状、显微鉴别、光谱法，由于市场上贝母类药材品种较多，相同品种间也会因为药源植物来源不一、种植环境、产地和加工等因素存在相当的混杂度,这就使得实验人员必须具备较高的药材鉴别经验。随着分子生物学技术的发展，使得中药材的分子遗传标记鉴别成为可能。目前文献上已有聚合酶链式反应(PCR)法鉴别川贝母药材的相关报道。

《中国药典》2015版已对川贝母引入了聚合酶链式反应-限制性内切酶长度多态性鉴别方法，但常规PCR存在需结合电泳分析、无法对扩增反应进行实时检测，以及EB试剂有毒害性等缺点。

发明内容

针对上述不足，本发明的目的是提供一种通过磁珠法提取川贝母中的DNA，该提取方法专属性强、富集效率高、操作相对简单。

一种提取川贝母品DNA的方法，依次包括下述步骤：

1)前处理样品

取1g试样，用研钵研成粉末，再精密称取20mg至2ml灭菌离心管中；

2)DNA的提取

样品的裂解：取前处理好的样品，加入400μL裂解缓冲液和已融化的核糖核酸酶A5μL，振荡混匀；置于70℃金属浴中10-30分钟，期间取出振荡混匀数次；5000转离心10分钟，取上清进行提取；取出试剂盒中96位深孔板，于A行分别加入已裂解样品300μL，连接缓冲液600μL，磁珠60μL；F行加入清洗缓冲液Ⅰ500μL；G行加入清洗缓冲液Ⅱ550μL；H行加入清洗缓冲液Ⅲ550μL；取出试剂盒中洗脱条，加入洗脱缓冲液100μL；将混合后的96位深孔板和洗脱条，置于核酸提取仪，进行DNA提取。

与现有技术相比，由于传统的DNA提取多以试剂法提取，常因步骤多，往往提取效率不高，以影响结果准确性；本发明采用磁珠法进行DNA提取，具有专属性强、富集效率高、操作相对简单等特点。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何在本发明权利要求保护范围所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围之内。

实施例1

1.材料与仪器

1.1药材

1.1.1川贝母对照药材(中国食品药品检定研究院，批号：121000-200405)川贝母1、2来源于安徽亳州中药材市场，川贝母3、4和5、平贝母、浙贝母和土贝母来源于广西玉林中药材市场，并经过形态学鉴定确认。

1.1.2试剂和引物磁珠法植物DNA提取试剂盒(美国热电公司，批号:00LSKFR804096F25N009)，SuperReal荧光定量预混试剂增强版(天根生化科技有限公司，批号：03120)，川贝母引物(invitrogen公司，批号：NSO_2954885，序列为：

5’CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA3’和

5’GCTACGTTCTTCATCGAT3’)。

所述的引物每管加超纯水0.29ml进行稀释，并涡旋振荡混匀使其充分溶解，于-20℃冰箱保存备用。

本发明所涉及到的百分浓度，没有特别说明的，液体均为体积浓度，溶质为固体的指质量浓度。

1.2仪器XA205DU电子天平(德国梅特勒托利多公司)、Minispin台式高速离心机(德国Eppendorf)、MINIB-100F恒温金属浴(杭州米欧仪器有限公司)、LightCycler96荧光定量PCR仪(瑞士罗氏公司)、ThermoFisherDuo核酸提取仪(美国热电公司)。

2.1样品的前处理取1g试样，用研钵研成粉末，再精密称取20mg至2ml灭菌离心管中。

2.2DNA的提取

2.2.1样品的裂解：取前处理好的样品，加入400μLLysisBuffer和已融化的RNaseA5μL，振荡混匀。置于70℃金属浴中10-30分钟，期间取出振荡混匀数次。5000转离心10分钟，取上清进行提取。