[发明专利]鲤鱼原代肝细胞的提取和培养方法

说明书

本发明公开了一种鲤鱼原代肝细胞的提取和培养方法，适用于生物工程技术领域，选鲤鱼进行解剖，无菌取肝脏并剪碎，用胰蛋白酶消化后经细胞筛过滤得细胞悬液，后经Percolll纯化，加入含有鲤鱼血清的培养液得到新的细胞悬液；用血小球计数板进行计数，再以最适培养条件铺板法培养增殖，最后对得到的原代肝细胞多种方法镜检鉴定。本发明鲤鱼原代肝细胞的纯化和培养方法直接无菌取鲤鱼肝脏，经Percolll纯化肝细胞，经鉴定，确实得到了数量多、纯度高的离体鲤鱼原代肝细胞，并用鲤鱼血清代替传统培养基中的配牛血清，提高了所提取离体细胞的活力，为进一步开展鲤鱼原代肝细胞毒理试验及其他实验打下基础。

技术领域

本发明涉及一种生物材料提取和培养方法，特别是涉及一种鱼类局部组织细胞的提取和培养方法，应用于生物工程技术领域。

背景技术

肝脏作为鱼体最大的解毒和代谢器官，在营养物质的消化吸收和保障鱼体健康方面起着重要作用。由于其复杂性与重要性，对鱼类肝脏的研究历来是鱼类生物学的重点内容，成果涉及鱼类解剖学、组织学、免疫学、生理学、病理学、毒理学、营养学等许多领域。由于体内肝脏毒性实验需要的动物样本量大、花费高昂，且实验结果的敏感性和重复性较差，开展体外细胞实验是解决这问题的方向。细胞培养最大的优势就是由于摆脱了实验动物整体存在时的局限性，通过建立细胞培养模型，可以提高实验的可操作性、重复性和结果的准确性。与传代肝细胞株相比，原代肝细胞能较好地保留和维持活体肝细胞的完整形态和代谢活性，突变和变异性小，可真实反应体内代谢情况。所以，原代肝细胞的培养为深入研究鱼类肝脏提供了一个有用的平台。

鲤鱼属鲤科，Cyprinidae，是一种原产亚洲的淡水鱼，在全国各地均有分布，是我国主要的养殖鱼种之一。鲤鱼具有很大的食用和观赏价值，深受我国广大消费者喜爱。所以作为我国水环境中典型鱼种之一，鲤鱼和人类联系紧密，可以通过探索鲤鱼自身受环境影响程度进而来评估环境对人类的影响。鉴于鱼类肝脏在机体中的重要性，通过在体外模拟肝细胞的生长环境，研究有毒物质对其代谢功能的影响，能更直观的体现出该有毒物质的代谢毒性，从而评价环境对鱼体的影响。所以提取鲤鱼原代肝细胞对进行环境毒理实验具有十分重要的意义，但通过目前的方法提取的鲤鱼原代肝细胞的纯度和活性不够理想。

发明内容

为了解决现有技术问题，本发明的目的在于克服已有技术存在的不足，提供一种鲤鱼原代肝细胞的提取和培养方法，采用无菌剪取鲤鱼肝脏，胰蛋白酶消化后经筛网过滤，经密度梯度离心后加入特定培养基中，得到鲤鱼原代肝细胞。本发明鲤鱼原代肝细胞的纯化和培养方法，能实现利用多种方法经行镜检鉴定，能够很好的保证离体肝细胞的纯度和活力，从而能够保证满足以鲤鱼肝细胞为实验对象的环境激素毒理实验及其他实验的需要，并为进一步开展更深层次的鲤鱼肝细胞毒理实验打下基础。

为达到上述发明创造目的，采用下述技术方案：

一种鲤鱼原代肝细胞的提取和培养方法，选择规格均匀、体格健壮的平均体重400-600 g的鲤鱼预养2周，然后，在无菌条件下进行如下过程：

a．无菌取鲤鱼肝脏和鲤鱼肝脏预处理：用鱼用麻醉剂将鱼麻醉5分钟后，用无菌注射器从尾静脉抽血至鱼腮微白，用剪刀从肛门处沿腹中线向前剪至下颌，再沿鳃盖后缘剪至下颌，打开左侧体壁肌肉，找到鲤鱼肝脏所在位置，用高压灭菌的解剖器具无菌取肝脏，并将之置于D-Hank’s平衡盐工作液中，用D-Hank’s平衡盐工作液清洗肝脏组织2-3次至肝脏发白，以洗去肝脏组织中残留的血液，完成鲤鱼肝脏预处理过程；

b．机械破碎鲤鱼肝脏和对鲤鱼肝脏和消化处理：将在所述步骤a中选取和经过预处理的鲤鱼肝脏剪碎成约1 mm × 1 mm 块状，再用D-Hank’s平衡盐工作液清洗肝脏组织块至少1次，然后加入块状鲤鱼肝脏的10倍体积的0.25%胰酶，在在25℃条件下进行40 min消化处理，在消化期间不断转动肝脏组织，消化处理后吸出大块肝脏组织，用移液枪温和吹打用机械切割力帮助肝脏组织消化，当向加入与胰酶同体积的培养基时停止消化过程，得到肝脏组织消化液；