[发明专利]鲤鱼原代肝细胞的提取和培养方法

权利要求书

1.一种鲤鱼原代肝细胞的提取和培养方法，其特征在于，选择规格均匀、体格健壮的平均体重400-600g的鲤鱼预养2周，然后，在无菌条件下进行如下过程：

a.无菌取鲤鱼肝脏和鲤鱼肝脏预处理：用鱼用麻醉剂将鱼麻醉5分钟后，用无菌注射器从尾静脉抽血至鱼腮微白，用剪刀从肛门处沿腹中线向前剪至下颌，再沿鳃盖后缘剪至下颌，打开左侧体壁肌肉，找到鲤鱼肝脏所在位置，用高压灭菌的解剖器具无菌取肝脏，并将之置于D-Hank’s平衡盐工作液中，用D-Hank’s平衡盐工作液清洗肝脏组织2-3次至肝脏发白，以洗去肝脏组织中残留的血液，完成鲤鱼肝脏预处理过程；

b.机械破碎鲤鱼肝脏和对鲤鱼肝脏和消化处理：将在所述步骤a中选取和经过预处理的鲤鱼肝脏剪碎成约1mm×1mm块状，再用D-Hank’s平衡盐工作液清洗肝脏组织块至少1次，然后加入块状鲤鱼肝脏的10倍体积的0.25％胰酶，在在25℃条件下进行40min消化处理，在消化期间不断转动肝脏组织，消化处理后吸出大块肝脏组织，用移液枪温和吹打用机械切割力帮助肝脏组织消化，当向加入与胰酶同体积的培养基时停止消化过程，得到肝脏组织消化液；

c.细胞悬液的制备：将在所述步骤b中制备的肝脏组织消化液经孔径为100μm细胞筛网过滤，得到细胞悬液，然后以1000rpm离心5min后，再移去上清，接着加入培养液轻轻吹打，使肝脏细胞重悬，然后用移液枪将细胞悬液缓慢温和地加到Percoll分离液上方，使Percoll分离液和细胞悬液的体积比为7:3，采用Percoll分离液的浓度为70wt％，然后在4℃条件下，以1000rpm再次离心10min，再取底层的肝脏细胞沉淀，然后将分离出来肝脏细胞中加入细胞培养液，并轻轻吹打，使肝脏细胞重悬，再次得到细胞悬液；当再次离心细胞悬液后，细胞悬液形成四层，在上而下分别为培养基层、死细胞、碎片和杂细胞混合层、分离液层和肝实质层，细胞沉淀取自肝实质层；

d.鲤鱼肝脏细胞培养：用细胞培养基液稀释在所述步骤c中最后制备的细胞悬液，使细胞悬液稀释到1×10⁶cells/ml的浓度水平，然后采用铺板法培养鲤鱼肝细胞，采用具有96孔板且每孔为200μl板进行铺板，使鲤鱼肝细胞在26℃条件下进行培养增殖，最终得到离体鲤鱼原代肝细胞；

在所述步骤a和b中，D-Hank’s平衡盐工作液组成为：由99ml的无Ca²⁺Mg²⁺的HBSS和1ml的浓度为1wt％双抗储液混合制备而成；

在所述步骤c中，Percoll分离液的配制：采用Percoll原液90mL与无Ca²⁺Mg²⁺HBSS的10mL进行混合，制成渗透压为335mOsm的Percoll工作液，然后取35mL的Percoll工作液与15mL无Ca²⁺Mg²⁺HBSS进行混合，并在1000rpm条件下离心3min，即获得浓度为70wt％的Percoll梯度分离液，并控制Percoll梯度分离液的密度为1.06～1.07g/mL，即得到所需的Percoll分离液，备用；

在所述步骤d中，进行铺板法时所用的培养基液组成为：按照70ml的L-15培养基、20ml的DMEM培养基、10ml的鲤鱼血清、1ml的浓度为0.01M的Hepes缓冲液、1ml的浓度为1wt％的双抗储液的混合组分配比进行混合，然后在按照上述组分比例配制培养基液后，再用浓度为1M的NaOH储液调节培养基液的pH至7.0-7.4之间，然后用0.22μm滤头过滤分装培养基液，得到培养基液，为铺板法备用；在制备培养基液时，其中鲤鱼血清的制备方法如下：用鱼用麻醉剂将鱼麻醉5分钟后，用无菌注射器从尾静采集鲤鱼血液，并将其置于不含抗凝剂的试管内，在室温下自然凝集30-40min，密封试管，以2000-3000rpm的速度离心10min，用移液枪将血清移出，然后在-20℃下进行保存，备用进行培养基液的制备。

2.根据权利要求1所述鲤鱼原代肝细胞的提取和培养方法，其特征在于：选择规格均匀、体格健壮的鲤鱼满足如下饲养条件：水温25±1℃，光照周期为光照:黑暗＝14h:10h，并且保持每天喂食两次。