[发明专利]一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法

权利要求书

1.一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

取待检样品和金标抗体混合，将混合后的样品通过副结核分歧杆菌抗原所在的区域，观察副结核分歧杆菌抗原所在区域的显色情况。

2.根据权利要求1所述的一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法，其特征在于，所述检测方法在胶体金试纸条上进行，且所述胶体金试纸条上依次设有用于放置待检样品的样品垫、设有金标抗体的胶体金结合垫和设有副结核分歧杆菌抗原的检测线。

3.根据权利要求2所述的一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法，其特征在于，所述胶体金试纸条由如下步骤制备得到：

（1）制备样品垫：采用纤维素滤纸条作为样品垫；

（2）制备胶体金结合垫：将金标抗体喷在玻璃纤维上，室温烘干；

（3）制备检测线：将偶联副结核分歧杆菌MAP1588C抗原-BSA用pH=7.4且浓度为0.01mol/L的PBS溶液稀释至0.4mg/ml，喷于硝酸纤维膜上，室温烘干；

（4）组装：将按步骤（1）制备得到的样品垫、步骤（2）制备得到的胶体金结合垫和步骤（3）制备得到的硝酸纤维膜按顺序放置并固定在聚氯乙烯板上；

（5）切片，将按步骤（4）组装好的聚氯乙烯板切割，即得所述胶体金试纸条。

4.根据权利要求3所述的一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法，其特征在于，所述检测线上远离胶体金结合垫的一侧设有吸水纸，所述吸水纸设在胶体金试纸条上。

5.根据权利要求3所述的一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法，其特征在于，所述金标抗体由如下方法制备得到：

（1）胶体金溶液的制备：取质量浓度为0.008-0.010%的氯金酸水溶液，加热至沸腾，立即加入质量浓度为0.08-0.1%的柠檬酸三钠水溶液；至溶液的颜色完全变为透明的酒红色时，停止加热并冷却至室温，低温贮存；其中所述氯金酸和柠檬酸三钠的质量用量比为1：3-4；

（2）鼠抗牛IgG的制备：取牛血清IgG抗原混合弗氏不完全佐剂后免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠SP2/0骨髓瘤细胞和脾细胞进行融合；筛选出稳定分泌抗牛血清IgG单克隆抗体的阳性细胞株，然后注射细胞进小鼠体内诱生腹水；取2ml鼠抗牛IgG腹水加入4ml浓度为0.06mol/LpH5.0的乙酸缓冲液，用0.1mol/L的HCl调pH至4.5，于室温搅拌下逐滴缓慢加入辛酸；按每毫升稀释前的腹水加入33μl并搅拌，低温静置后低温离心，取上清液，上清液经过滤后加入1/10体积的pH7.4的PBS，冰浴下加入0.277g/ml的硫酸铵，静置后低温离心，弃上清，沉淀溶于0.01mol/LPBS中进行透析；

（3）金标抗体的制备：取步骤（1）制备的胶体金溶液，加入K2CO3调节其pH为8.2，搅拌均匀，缓慢滴加步骤（2）制备的鼠抗牛IgG溶液，搅拌条件下依次加入1%PEG和10%BSA溶液；搅拌均匀，低温低速离心取上清液低温高速离心，吸去上清后用缓冲液重悬沉淀；其中，所述胶体金和鼠抗牛IgG体积的比例为100:2-3。

6.根据权利要求3所述的一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法，其特征在于，所述副结核分歧杆菌MAP1588C抗原由如下方法制备得到：从副结核分歧杆菌基因组中扩增出MAP1588C基因片段，插入原核表达载体pET-28b（＋），转化至大肠杆菌BL21（DE3），在0.5mmol/L的IPTG诱导下进行表达；利用融合蛋白的组氨酸标签进行亲和层析纯化重组蛋白，即得所述副结核分歧杆菌MAP1588C抗原。

7.根据权利要求4所述的一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法，其特征在于，所述待检样品的制备过程为：

取待检牛血液1ml，于室温下自然凝集，然后分离血凝块并离心,取上层血清加入生理盐水即得所述待检样品，其中所述上层血清和生理盐水的体积比为1：4-5，即得待检样品。

8.根据权利要求7所述的一种副结核分歧杆菌抗体的检测方法，其特征在于，所述胶体金试纸条硝酸纤维膜上检测线和吸水纸之间设有用于放置兔抗鼠IgG抗体的质控线，所述质控线和检测线之间的距离为3mm。