[发明专利]一种脐血NK细胞的体外扩增方法及其试剂盒与应用

权利要求书

1.一种脐血NK细胞的体外扩增方法，包括以下步骤：

1)活化培养脐血NK细胞：用淋巴细胞培养基调整脐血单个核细胞密度为0.5～5×10⁶个/mL，再至少添加1～10μg/mL唑来膦酸和200～2000IU/mL重组人白介素-2，在36℃～40℃、5％CO₂饱和湿度环境中培养1～5天，收集细胞液；

2)增殖培养脐血NK细胞：从步骤1)的细胞液中获取细胞，用GMP S&XFM^TM-CD淋巴细胞培养基调整细胞密度为0.5～5×10⁶个/mL，再添加200～2000IU/mL重组人白介素-2，在36℃～38℃、5％CO₂饱和湿度环境中培养，每隔2-3天补充新鲜培养基并调整细胞密度为0.5～5×10⁶个/mL，培养14～35天，收获得到脐血NK细胞。

2.根据权利要求1所述的脐血单个核细胞的体外扩增方法，其特征在于：所述步骤1)中用到的脐血单个核细胞分离自新鲜抗凝脐血或冻存复苏脐带血，分离过程如下：

1.1取新鲜抗凝脐血或冻存复苏脐带血，用1～2倍体积的PBS稀释；

1.2向淋巴细胞分离液上方缓慢加入等体积的稀释脐血，保持两液面界面清晰；

1.3室温980g，离心20～30min；

1.4离心结束后，吸取上面第二层的白膜状的单个核细胞层，用PBS清洗，得到脐血单个核细胞。

3.根据权利要求1或2所述的脐血NK细胞的体外扩增方法，其特征在于：所述步骤1)中的淋巴细胞培养基可为AIMMedium CTS^TM(购自美国Life Technology公司)或GMP S&XFM^TM-CD细胞培养基，优选为GMP S&XFM^TM-CD细胞培养基。

4.根据权利要求3所述的脐血NK细胞的体外扩增方法，其特征在于：所述步骤1)中的淋巴细胞培养基为AIMMedium CTS^TM，活化培养优选为：用AIMMedium CTS^TM淋巴细胞培养基调整细胞密度为1～3×10⁶个/mL，再添加1～5μg/mL唑来膦酸和500～1500IU/mL重组人白介素-2，在36℃～38℃、5％CO₂饱和湿度环境中培养2～4天；活化培养更优为：用AIMMedium CTS^TM淋巴细胞培养基调整细胞密度为2×10⁶个/mL，再添加2μg/mL唑来膦酸和1000IU/mL重组人白介素-2，在37℃、5％CO₂饱和湿度环境中培养3天。