[发明专利]一种红霉素的合成调控基因phoP及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于涉及基因工程技术领域，具体地说，涉及一种红霉素的合成调控基因phoP及其制备方法和应用。

背景技术

红霉糖多孢菌(Saccharopolysporaerythraea)是一种革兰氏阳性丝状细菌，它最初被认为属于链霉菌属，曾一度被称为“红色链霉菌”(Streptomyceserythraeus)，但是后来进一步研究发现它其实是属于糖多孢菌属。

糖多孢红霉菌在工业上广泛用于红霉素(erythromycin,Er)的规模化生产。红霉素是一种抗革兰氏阳性细菌的天然广谱抗生素,在医药畜牧业上都得到了应用,尤其是在抗菌治疗上有着重要意义。这种大环内酯类的广谱抗生素自J.M.McGurie最初发现至今已有逾六十年历史。然而红霉素因其高效的治疗效果和使用的安全性至今仍然在医药界被广泛应用。红霉素的组要活性组分是红霉素A。此后，人们对红霉素A的分子结构进行改造并由此演变出丰富多样更加有效的衍生物。迄今，红霉素的应用和改造可以分为三代。第一代的红霉素不耐酸，易被胃酸降解成了其致命缺点。半合成的第二代衍生物比如克拉霉素(Clarithromycin)和阿奇霉素(Azithromycin)和第三代衍生物酮内酯类抗菌药(ABT-773和HMR-3647)不仅具有更好的疗效作用，也增加了红霉素A作为初始原料的使用需求，从而推动了整个红霉素在医药市场的发展。

传统的菌株改造采用的是突变-筛选模式来获得高产菌株，提高红霉素产量。这种突变-筛选模式主要基于对野生菌的多轮随机诱变，进而大量筛选得到高产的突变菌株。这种近乎暗箱操作的菌株优化方法不仅耗时耗力且往往效率低下。70年代以来工业微生物的基因改造技术为工业微生物的理性改造提供了巨大潜力。随着测序技术的进步，2007年剑桥大学的研究者们完成了对红霉糖多孢菌野生株(S.erythraeaNRRL23338)全基因组的测序工作。加之清晰的红霉素生物合成的分子生物学过程，使得通过基因工程的手段来提高红霉素产量、优化组分或合成新型抗生素，显示出了广阔的前景。

通过基因工程改造红霉糖多孢菌以提高红霉素产量有两个策略：一是在对红霉素合成生化途径的了解的基础上，通过理性改造提高红霉素合成前体丙酰辅酶A(propionyl-CoA)和甲基丙二酰辅酶A(methylmalonyl-CoA)的代谢流；二是高表达红霉素合成调控基因，提高红霉素合成相关基因的转录水平，增加红霉素合成效率。但是，不同于其他抗生素生产菌，红霉糖多孢菌基因组中尚未发现红霉素合成的直接高效调控基因。因此，现在研究的重点仍然是红霉素合成途径和前体供给回路。这些现状都直接提出了对于抗生素合成调控相关基因的研究的紧迫性，这也是目前对于放线菌领域研究的重要部分。

基于上述研究，本发明通过生物信息学及分子生物学研究发现红霉糖多孢菌磷代谢调控基因phoP编码的双组分调控蛋白PhoP直接激活红霉素合成基因的转录。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种新的促进红霉素生物合成的调控基因phoP及其制备方法和应用。并且，提供一种使用该调控基因phoP促进红霉素合成并提高红霉素产率的方法，利用该方法获得红霉素高产菌株。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种红霉素的合成调控基因phoP，所述合成调控基因phoP的核苷酸序列选自下列三种中的一种：

(1)序列表中的序列SEQIDNO:1；

(2)与SEQIDNO:1所示核苷酸编码相同蛋白的核苷酸序列，所述编码相同蛋白的序列为SEQIDNO:2所示；

(3)编码将SEQIDNO:2蛋白经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQIDNO:2相同功能的蛋白突变体的核苷酸序列。

所述合成调控基因phoP的制备方法，该合成调控基因phoP来源于放线菌，通过过表达红霉糖多孢菌基因组中的phoP基因，得到突变菌。

所述phoP基因的过表达通过重组整合插入基因组内的方法实现。

所述制备方法还包括双交换同源重组基因敲除的方法，步骤如下：

1)在过表达质粒pIB139的MCS内插入预过表达基因phoP的CDS基因编码序列，得到phoP基因过表达的pIB139-phoP质粒；

2)将phoP基因过表达的质粒pIB139-phoP质粒通过原生质体转化方法导入到预先制备的红霉糖多孢菌野生株原生质体中，得到phoP基因过表达的突变菌；

3)在含安普霉素抗性平板上筛选突变菌，并通过PCR和RT-PCR的方法验证突变菌。