[发明专利]一种基于核酸适配体和纳米模拟酶检测卡那霉素残留的电化学检测方法

权利要求书

1.一种基于核酸适配体和纳米模拟酶检测卡那霉素残留的电化学检测方法，其特征在于具体步骤如下：

（1）金纳米颗粒模拟酶的制备：利用酪氨酸作为还原剂和捕获剂制备而成金纳米颗粒模拟酶：将含有0.1~0.5mM酪氨酸和0.1~0.5 mM KOH的300mL超纯水溶液煮沸3~5min，立即加入1.02mL质量体积比为1%~3%的氯金酸溶液并在沸水浴中保温5~10min；继续在沸水浴中持续沸腾至溶液体积减少至30mL，得到不同粒径的金纳米颗粒溶液；将上述金纳米颗粒溶液提前在沸水中处理过的截留分子量为12 kDa的透析袋中透析除去多余的KOH、金属离子及酪氨酸，得金纳米颗粒模拟酶，置于4℃冰箱中保存备用；

（2）功能化金纳米颗粒的制备：

a、适配体的预处理：

卡那霉素适配体的序列为：5’-TGGGGGTTGA GGCTAAGCCG A-3’；

将上述适配体稀释到600 nM，在95℃保温10~15min使适配体变性后，立即将其转移到冰浴中5~10min，最后恢复至室温备用；

b、孵育：将上述处理过的适配体溶液与步骤（1）制备得到的等体积的金纳米颗粒模拟酶溶液在室温下孵育20~30min，适配体即通过含氮碱基稳定附着在金纳米颗粒表面；

c、后处理：将步骤b所得混合溶液在4℃，8000rpm条件下离心10min，以除去未结合的适配体，并重悬于等体积的pH 4.0，0.2 mM HAc-NaAc缓冲液中，得到功能化的金纳米颗粒溶液；

（3）卡那霉素样品与功能化金纳米颗粒的置换反应以及金纳米模拟酶的催化反应：往1mL步骤（2）所得功能化的金纳米颗粒溶液中加入pH 4.0 0.2mM HAc-NaAc的缓冲液4mL，然后将不同浓度的卡那霉素待测样品加入到上述体系中；加入0.998 M，20μL的底物过氧化氢，和购买得到的还原态的硫堇粉末用超纯水配制成的2mM的硫堇溶液50μL，在25~60℃水浴中反应20min；

（4）电化学测定：

d、电极预处理：用0.5µm及0.05µm的氧化铝粉末在抛光布上先后打磨金电极表面；然后对金电极进行40Hz超声清洗，依次用超纯水、无水乙醇、超纯水分别超声处理3~5min，最后一次用超纯水清洗后，氮气吹干金电极表面；将金电极作为工作电极，铂丝电极作为对电极，Ag/AgCl作为参比电极以构建三电极体系；将电极置于0.5 mol/L的H₂SO₄溶液中在-0.2~1.5 V电位范围内以100 mV/s的扫描速度循环扫描，于0.8V的峰值不再增加即为清洗完成；用超纯水冲洗金电极表面3次，氮气吹干，使金电极表面光滑干净完成电极的预处理；

e、测定：采用差分脉冲伏安法进行电化学检测，将步骤d预处理后的金电极置于步骤（3）所得催化反应液中，记录不同卡那霉素浓度下纳米模拟酶催化产生氧化态硫堇的电流值，建立峰电流与卡那霉素浓度间的线性关系，从而实现对卡那霉素的检测；

（5）样品检测：采用差分脉冲伏安法对反应体系中的氧化态硫堇进行电化学检测，该方法具体参数设置为：电压范围0.3V~ -0.3V，电压增量4 mV，振幅50 mV，脉冲宽度0.05 s，采样宽度0.0167 s，脉冲周期0.05 s，静置时间2 s；取待检测的样品，以步骤（1）-（4）同样的步骤和试剂对其进行检测，通过电流值得到待测样品中的卡那霉素浓度。

2.根据权利要求1所述基于核酸适配体和纳米模拟酶检测卡那霉素残留的电化学检测方法，其特征在于：所述样品为牛奶或蜂蜜样品。