[发明专利]体外重组人体皮肤表皮模型及其制备方法和应用

说明书

一种体外重组人体皮肤表皮模型，在基底细胞层下表面有一层半桥粒蛋白，基底细胞层上表面覆盖有6～8层短凸起棘细胞的棘层细胞层，棘层细胞层上表面覆盖有由3～4层含有透明颗粒细胞的颗粒细胞层，颗粒细胞层上表面覆盖有角质细胞层，各细胞层之间分层明显，脂质组成整体屏障功能接近于人体皮肤。制备方法由制备基质胶微粒、筛选扩增表皮干细胞、制备基底细胞层、制备棘细胞层、制备颗粒细胞层、体外重组表皮模型的成熟与角化步骤组成。该模型在具有人体皮肤屏障修复功效的化妆品评价中的用途，在具有人体皮肤屏障修复功效的植物提取物筛选中的用途，在评价医疗器械材质对人体皮肤刺激性检测中的用途，在化学品皮肤刺激性检测中的用途。

技术领域

本发明属于生物材料技术领域，具体涉及人体表皮模型。

背景技术

在生物医学研究领域中，针对皮肤洗护、接触物、护肤用品等的安全性评价一直采用动物实验为主要研究、验证模型。由于种间差异，实验动物无法精确复制人类皮肤表现出的复杂生物学、生理学特征，使实验结果存在偏差和片面性，甚至得出错误结论。随着欧盟动物保护福利和3R(减少、优化和替代)原则的推行，体外替代方法已经作为现代毒理学研究系统的主要模式和生物医学发展的新方向之一，被欧洲政府及国际法规所接受并推行。动物实验甚至成为国际贸易关系中的技术壁垒，因此，动物实验体外替代方法的开发和研究也逐渐受到了中国的重视。例如，以人源性细胞体外培养技术为基础构建的皮肤替代模型，被广泛应用于皮肤安全性评价以及化妆品功效性测试，为护肤相关产品的检测提供了精准工具。

皮肤是人体最大的器官，表皮是皮肤的最外层结构，由上到下主要分为：1.角质层，由多层扁平的角化细胞组成，是皮肤屏障的重要结构；2.颗粒层，位于角质层下方，典型特征是细胞质内含有许多透明角质颗粒；3.棘层，位于颗粒层下方，细胞较大，成多边形，向四周伸出许多细短的突起；4.基底层，位于基底膜上，由一层柱状基底细胞组成，具有活跃的增殖能力。

目前，国际上已有可用于体外皮肤安全性测试的重组皮肤模型，包括只由表皮结构和真皮脱细胞基质形成的皮肤模型；具有成纤维细胞真皮层和表皮层的全层皮肤模型以及含有成纤维细胞、表皮细胞和黑色素细胞的皮肤模型等。随着重组皮肤模型的研发与应用，促进了皮肤生物学研究领域中非临床研究工作的开展，如皮肤屏障渗透、创伤愈合、色素控制、皮肤力学性质、皮肤衰老以及皮肤疾病研究等。

含有表皮层和真皮层的全层皮肤，真皮层是通过对成纤维细胞体外诱导，使其发生细胞分化和胞外基质的形成等一系列变化，最终形成类似于真皮的结构。或者采用生物聚糖等材料或胶原作为支架，填充成纤维细胞，进行体外培养交联形成类真皮结构。然后在已构建的真皮表层，覆盖一定密度的表皮细胞，进行共培养，利用真表皮之间的相互作用及体外诱导因素，支持表皮细胞的生发和分化，最终形成结构类似于完整皮肤的模型。虽然表皮细胞和成纤维细胞之间的相互作用更类似与天然皮肤的状态，但该模型在应用方面的优势特点报道很少，在化工产品的安全性评价应用方面的报道更少，主要用于皮肤生理的基础学研究。并且，模型构建工艺繁琐，制备周期长，结构复杂。此外，在应用中该类模型的制备也存在着一定的弊端，如在模型制备过程中，下层成纤维细胞的来源，数量以及状态的差异性对于表皮细胞的增殖及分化有较大影响，造成模型稳定性差，影响模型对化学物质评判的准确性。另外由于成纤维细胞在体外分化的过程中，会自身分泌的胶原，对外界的胶原支架或者其他生物材料支架进行塑形，易导致真皮部分乃至模型收缩，引起测试物从模型边缘的渗漏，干扰测试结果的评判；最后，成纤维细胞的存在也要求构建体系的培养液必须含有血清，引进了不可预估的安全风险。

为了排除成纤维体系的不稳定性，目前不含有成纤维细胞的体外重组皮肤模型被认为是用于评估、研究物质刺激性的优秀模型，其结构简单，不含真皮部分，但功能完善，应用广泛。

重组表皮模型的构建主要利用不含细胞的类真皮胞外基质作为支架材料或者是含有成纤维细胞的真皮结构支持表皮生发，体外诱导其分化形成典型的基底层，棘层，颗粒层以及角质层结构。模型在分化过程中，角质形成细胞经过分化和细胞外基质共同构成角质层，使得重组表皮模型具有类似天然皮肤同样的屏障功能，从而形成体外安全性检测的结构基础。