[发明专利]体外重组人体皮肤表皮模型及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种体外重组人体皮肤表皮模型的制备方法，由下述步骤组成：

(1)制备基质胶微粒

将基质胶用无血清表皮细胞培养基稀释至50～150μg/mL，置于36～37℃、5％CO₂培养箱，孵育2～4小时，基质胶溶液形成胶颗粒逐渐沉降，弃去未凝固的基质胶，重复该步骤3次，得基质胶颗粒，将基质胶颗粒置于真空干燥箱中进行冷冻干燥，制备成基质胶微粒；

(2)筛选扩增表皮干细胞

将离体的人皮肤组织浸没于1.2U/mL的质量分数为1％的Dispase酶消化液中，36～37℃浸泡1～2小时，放入37℃胰酶消化液中，37℃消化8～10分钟，无菌条件下用200目筛网过滤，离心，收集细胞，制备成3×10³个/ml～5×10³个/ml的细胞悬液，细胞悬液与基质胶微粒按质量体积比为5：1混合，置于10ml的旋转培养系统进行微重力旋转培养，转速为22转/分，旋转培养20分钟，弃去培养液，得表皮干细胞，将新鲜的基质胶微粒与无血清表皮细胞培养液按质量体积比为5:1混合，制备成表皮干细胞扩增液，表皮干细胞在表皮干细胞扩增液中培养5～7天，隔天换液，完成表皮干细胞的扩增；

上述100mL的胰酶消化液中含0.025g胰酶、0.01g的乙二胺四乙酸；

(3)制备基底细胞层

将表皮干细胞从基质胶表面用胰酶消化液消化，用培养液TU1进行重悬，接种于细胞小室中，接种密度为0.2×10⁵～0.5×10⁵个/cm²，在细胞小室内液下培养，置于5％CO₂、36～37℃的细胞培养箱中孵育24～48小时，制备成下表面具有一层半桥粒蛋白的基底细胞层；

上述培养液TU1为：在500mLFAD基础液中添加表皮生长因子0.5～5μg、腺嘌呤5～25mg、转铁蛋白2.5～6μg、角质形成细胞生长因子0.5～5μg，该基础液用F12与培养液DMEM的体积比为1:3混合配制；

(4)制备棘细胞层

将步骤(3)中的培养液TU1替换为培养液TU2,在含有基底细胞层的细胞小室内添加150～200μl培养液TU2，在36～37℃、5％CO₂、95％相对湿度的细胞培养箱中孵育24～48小时，制备成6～8层具有短凸起的棘细胞层；

上述培养液TU2为：在500mLFAD基础液中添加表皮生长因子0.5～5μg、腺嘌呤5～25mg、转铁蛋白2.5～6μg、角质形成细胞生长因子0.5～5μg、胰岛素1-10mg、L-肉碱0.001～0.1mM、牛血清白蛋白0.01～0.05mM、氯化钙0.03～0.2mM，FAD基础液用F12与培养液DMEM的体积比为1:3混合配制；

(5)制备颗粒细胞层

替换步骤4中的培养液TU2为培养液TA1，弃去步骤4中细胞小室内的TU2液体，进行气液面培养，36～37℃、5％CO₂、95％相对湿度的细胞培养箱中孵育72～96小时，48小时更换新鲜的培养液TA1，制备成由3～4层含有透明颗粒的细胞构成的颗粒细胞层；

上述培养液TA1为：500mLFAD基础液中添加表皮生长因子0.5～5μg、腺嘌呤5～25mg、转铁蛋白2.5～6μg、胰岛素1～10mg、氢化可的松10～100μg、牛血清白蛋白0.01～0.05mM、氯化钙0.03～0.2mM、L-丝氨酸0.01～0.1mM、棕榈酸0.01～0.05mM、油酸0.01～0.05mM、精氨琥珀酸0.05～0.1mM、牛血清白蛋白0.01～0.05mM、氯化钙1.0～1.5mM、维生素C15～25μg，该FAD基础液用F12与培养液DMEM的体积比为1:3混合配制；

(6)体外重组表皮模型的成熟与角化

将步骤(5)中的培养液TA1更换为培养液TA2，进行气液面培养，置于33～35℃、5％CO₂、95％相对湿度的细胞培养箱中培养4～5天，48小时更换新鲜的培养液TA2；制备成厚度为100～150μm的体外重组人体皮肤表皮模型；

上述培养液TA2为：在500mLFAD基础液中添加表皮生长因子0.5～5μg、胰岛素1～10mg、氢化可的松10～100μg、牛血清白蛋白0.01～0.05mM、氯化钙1.0～1.5mM、维生素C10～15μg、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子5～10μg，该FAD基础液用F12与培养液DMEM的体积比为1:3混合制成。