[发明专利]一种提取檀香木材组织总RNA的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种提取檀香木材组织总RNA的方法。

背景技术

檀香(SantalumalbumL.)为檀香科(Santalaceae)檀香属(Santalum)半寄生常绿乔木， 为名贵、珍稀植物，主要分布于印度、印度尼西亚、澳大利亚及太平洋的一些群岛。人类利 用它已有数千年的历史，因其木材可用于雕刻和提炼檀香油而格外出名，素有“绿色黄金” 之称。中国无檀香的原生分布，其成品或半成品过去一直从国外进口。1962年中国科学院华 南植物园在大陆首次从印尼引入檀香种子繁育成功，其后从印度引入“老山香”优质种源也 获得成功。经过几十年的研究试验，如今檀香在华南植物园已能结籽繁殖并能“结香”。檀香 木材中提取的檀香油主要成分为α和β檀香醇，具挥发性，强烈的香味，经济价值极高，但檀 香油形成的机制尚不清楚。从生物组织中提取高质量的总RNA对于分析基因的表达和调控、 基因克隆及其功能鉴定、分子标记辅助育种等具有重要意义。

不同生物组织，特别是高等植物，常常由于富含多酚氧化物、多糖、蛋白质等，使得其 总RNA提取十分困难。檀香木材组织中含多糖、多酚、油脂等多种次生代谢成分，其总RNA 提取更加困难。因此，有必要开发一种能高效、完整的提取檀香木材组织中总RNA的方法， 为从基因水平上深入研究檀香油形成的机制及其他相关分子生物学研究提供基础。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中檀香木材组织总RNA提取困难的不足，提供一种高质量 提取檀香木材组织总RNA的方法。

本发明的提取檀香木材组织总RNA的方法，包括以下步骤：

取檀香木材组织磨成粉末后，加入到异硫氰酸胍提取液中，冰浴后离心，取上清在其中 加入SDS缓冲液后混匀，然后再加入水饱和酚/氯仿/异戊醇混匀，离心，取上清在其中再加 入氯仿混匀，离心，取上清在其中加入无水乙醇和醋酸钠溶液沉淀RNA，离心去上清取沉淀， 再经乙醇洗涤后，得总RNA。

所述的异硫氰酸胍提取液为：每升含有4mol异硫氰酸胍，2mmolTris-HCl，10mlβ-巯 基乙醇，pH＝8.0；所述的SDS缓冲液为每升含有2gSDS、100mmolNaCl，50mmolTris-HCl， 10mmolEDTA，pH＝8.0；所述的水饱和酚/氯仿/异戊醇为由水饱和酚、氯仿和异戊醇按照体 积比25∶24∶1混合而成；所述的醋酸钠溶液为3mol/L的醋酸钠溶液，pH＝5.2。

优选，具体步骤如下：

(1)取檀香木材组织在液氮中磨成粉末，转入冰浴的、盛有足量异硫氰酸胍提取液的离 心管中，旋涡混匀，冰浴15min，4℃、12000r/min离心15min；

(2)将上清液转入新的离心管中，加入SDS缓冲液，振荡混匀，再加入等体积的水饱 和酚/氯仿/异戊醇，旋涡混匀，4℃、12000r/min离心20min；

(3)将上清液转入新离心管中，加入等体积氯仿，振荡混匀，4℃、12000r/min离心20 min；

(4)将上清液转入新离心管中，加入2倍体积的无水乙醇和0.1倍体积的3mol/L、pH5.2 的醋酸钠溶液，-20℃静置2h以上，4℃、12000r/min离心20min；

(5)弃上清液，将沉淀用体积分数75％的乙醇冲洗1～2次，4℃、12000r/m离心15min， 弃上清，晾干沉淀，沉淀即为檀香木材组织总RNA，再用DEPC水充分溶解后保存。

优选，所述的步骤(1)的足量异硫氰酸胍提取液是指每1g檀香木材组织粉末至少需要 1.5mL异硫氰酸胍提取液。

优选，所述的步骤(5)的晾干沉淀前先短暂离心，再把残余的乙醇用移液枪吸走。