[发明专利]一种含有碳氮键的His-Vx3-eGFP蛋白-纳米铝共价偶联泛素化蛋白及其提取方法和应用

权利要求书

1.一种含有碳氮键的His-Vx3-eGFP蛋白-纳米铝共价偶联泛素化蛋白，其特征在于，所述泛素化蛋白是由His-Vx3-eGFP蛋白和经过修饰后的纳米铝，通过碳氮双键形成偶联物，然后偶联物再与经过处理后的肿瘤细胞裂解液孵育，即得所述泛素化蛋白；泛素化蛋白的提取方法，包括以下步骤：

(1)利用三乙氧基硅烷，对纳米铝颗粒进行修饰；修饰方法为：纳米铝与过量的三乙氧基硅烷室温下搅拌反应，使三乙氧基硅烷与纳米铝上的羟基反应；

(2)将修饰后的纳米铝与戊二醛反应，使醛基连接至纳米铝，然后加入His-Vx3-eGFP蛋白，通过生成碳氮双键形成His-Vx3-eGFP蛋白-纳米铝共价偶联物；

(3)培养肿瘤细胞，抑制泛素化蛋白的降解，经细胞裂解液处理，离心得上清液；抑制泛素化蛋白降解的方法为：培养的肿瘤细胞生长至80％，加入万珂和氯化铵，加入量分别为160nmol/L-240nmol/L和25mmol/L-35mmol/L，干预肿瘤细胞14-18小时，抑制泛素化蛋白的降解；

(4)将步骤(2)所得共价偶联物和步骤(3)所得上清液共孵育，即得所述泛素化蛋白α-Al₂O₃-His-Vx3-eGFP-Ub。

2.权利要求1所述的含有碳氮键的His-Vx3-eGFP蛋白-纳米铝共价偶联泛素化蛋白的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)利用三乙氧基硅烷，对纳米铝颗粒进行修饰；修饰方法为：纳米铝与过量的三乙氧基硅烷室温下搅拌反应，使三乙氧基硅烷与纳米铝上的羟基反应；

(2)将修饰后的纳米铝与戊二醛反应，使醛基连接至纳米铝，然后加入His-Vx3-eGFP蛋白，通过生成碳氮双键形成His-Vx3-eGFP蛋白-纳米铝共价偶联物；

(3)培养肿瘤细胞，抑制泛素化蛋白的降解，经细胞裂解液处理，离心得上清液；抑制泛素化蛋白降解的方法为：培养的肿瘤细胞生长至80％，加入万珂和氯化铵，加入量分别为160nmol/L-240nmol/L和25mmol/L-35mmol/L，干预肿瘤细胞14-18小时，抑制泛素化蛋白的降解；

(4)将步骤(2)所得共价偶联物和步骤(3)所得上清液共孵育，即得所述泛素化蛋白α-Al₂O₃-His-Vx3-eGFP-Ub。

3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)中所述修饰后的纳米铝与戊二醛反应的条件为：常温搅拌反应2h。

4.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)中所述His-Vx3-eGFP蛋白是由以下方法制得：

复苏转化了His-Vx3-eGFP表达质粒的大肠杆菌，诱导其表达蛋白，采用镍离子层析法提取所述His-Vx3-eGFP蛋白。

5.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)中所述培养肿瘤细胞为按照常规方法培养。

6.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤(4)中所述共孵育为4℃共孵育过夜。

7.权利要求1所述的含有碳氮键的His-Vx3-eGFP蛋白-纳米铝共价偶联泛素化蛋白在制备抗肿瘤疫苗中的应用。