[发明专利]一种非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂的生产方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及一种非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂的生产方法。

【背景技术】

由尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)引起的作物枯萎病是一种世界性 土传病害，也是造成作物连作障碍的主要原因之一(刘波等，2013)。一般 造成10％-30％产量损失，严重者可导致绝收，及时有效防控成为茄科和瓜 类作物安全生产的重大需求(Kaur等，2010；杨莹莹等，2012)。目前， 防治枯萎病的主要策略为化学防治和培育抗病品种，化学防治污染环境且危 害人类健康，抗病品种培育困难且存在抗性减弱的风险，因此，有必要开辟 更多的防治途径。近年来，利用植物的免疫系统开发安全、高效、无残留的 “植物疫苗”研究成为了热点。

随着植物免疫学研究的持续与深入，研究者发现植物在长期的演化过程 中，逐步发展了类似于动物的“免疫系统”来抵抗病害(Ausubel，2005)。 植物除了已具有的先天免疫的能力外，还可通过接种弱致病性或非致病性菌 株诱导其产生主动抗病性，类似于动物的疫苗接种，激活植物的免疫系统和 生长系统，提高作物自身免疫能力，从而增强植物抗病和抗逆能力(邱德文， 2008)。因此，利用生物诱导抗性的原理，开发新型生物制剂“植物疫苗” 防治病害，符合“生态文明”要求，有助于增产、增收及农产品品质提升。

非致病尖孢镰刀菌是天然的植物疫苗菌株。已有部分研究报道其能促 进作物生长，并且能有效降低作物枯萎病的发生。Elmer(2004)研究表明， 提前接种非致病菌株CS-20，7d后接种致病菌，84d观察发现菌株CS-20 能够在芦笋植株根部定殖，并可提高根部鲜重和减少根部病斑。Abeysinghe (2006)研究表明，提前接种非致病性尖孢镰刀菌能显著降低黄瓜根腐病与 茎腐病的发病率。杨猛等(2005)研究表明，提前在土壤中接种Fo47和 Fo47B10能提高黄瓜和西瓜植株的抗逆性和生长发育，且对黄瓜霜霉病有明 显的防治效果。钱晓雍等研究发现非致病性镰刀菌IF23、251/2和MSA35 的接种浓度会影响番茄枯萎病的防治效果。

本发明所使用的菌株非致病性尖孢镰刀菌菌株FJAT-9290是一株天然 的植物疫苗菌株，前期研究已表明，该菌株不会引起茄科、葫芦科、芭蕉科 和百合科等作物发病，且在茄科、葫芦科及芭蕉科等作物上具有良好的定殖 能力，可达40-90天。采用提前施用的方法能促进植物生长，且对番茄枯萎 病有较好的防治效果，其中盆栽防治效果为76.70％，田间小区防治效果为 69.56％，略高于化学农药50％多菌灵可湿性粉剂处理的防治效果68.64％(肖 荣凤等，2015)。为本发明的实现提供了菌株基础。

【发明内容】

本发明要解决的技术问题，在于提供一种非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗 制剂的生产方法，其制备的植物疫苗制剂对作物有促长、抗病的效果，可解 决番茄枯萎病难以防治的问题，并达到减少化学农药使用的目的。

本发明是这样实现的：

一种非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂的生产方法，所述方法步骤如 下：

步骤(1)生产用液体菌种的制备：以非致病性尖孢镰刀菌FJAT-9290 (Fusariumoxysporum)为菌种，以马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基和查氏酵 母培养液为液体菌种用培养基，制备生产用液体菌种；

步骤(2)非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗制剂的制备：以猪粪废弃物为 主要成份制备植物疫苗生产的固体培养基物，与麸皮、麦粒混合后，分装于 聚丙烯塑料袋中，灭菌后，接种步骤(1)所制备的液体菌种，28-30℃恒温 培养发酵18-20天，制备植物疫苗固体发酵产物，发酵结束后将其拌匀， 即得非致病性尖孢镰刀菌植物疫苗；

所述尖孢镰刀菌FJAT-9290(Fusariumoxysporum)，于2012年3月 29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京 市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.5910。

进一步地，所述步骤(1)中生产用液体菌种制作步骤具体为：

步骤A.菌种的活化：配置PDA培养基，121℃灭菌20min，冷却至45 ℃倒于灭菌平板中，备用；取-70℃保存的非致病性尖孢镰刀菌FJAT-9290 (Fusariumoxysporum)菌株于PDA培养基平板上划线培养，28～30℃恒温 培养5～7天；